d****h
发帖数: 4291 | 1 probe1 和probe2 相差三个碱基
蛋白为纯化的原核表达蛋白，上样量如图
probe为生物素3'标记
请教
1、probe2看上去条带sharp是因为这三个碱基造成的么？
2、条带是否sharp是由那些因素决定的？
3、到底是sharp的带结合紧密呢还是不sharp的带紧密？
多谢！ |
|
h******d
发帖数: 92 | 2 请问一些基础的问题：
独立转录的一个基因，它的转录起始位点有没有可能在它上游基因的终止密码子之前？
它的转录终止位点是否有可能在它下游基因的起始密码子之后？(能不能提供一个或者
几个具体的例子，给个文献什么的)
一般细菌的启动子和终止子有多长？
几个同向的基因，一般它们的基因间距离小于多少bp，我们可以推测它们属于一个转录
本？
一般有什么实验方法证明几个同向的基因属于不属于一个转录本？
非常感谢 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 3 一直以为国内“operon”的翻译是“转录元”，原来是“转录本” |
|
h******d
发帖数: 92 | 4 不同的书和学校，翻译很多都不一样。
我大学时学校是转录本，研究生的学校是转录元，其实没差，不过先入为主，习惯性的
翻译成转录本 |
|
|
h***e
发帖数: 146 | 6 独立转录的一个基因，它的转录起始位点有没有可能在它上游基因的终止密码子之前？
它的转录终止位点是否有可能在它下游基因的起始密码子之后？(能不能提供一个或者
几个具体的例子，给个文献什么的)
这两个的答案都是肯定的 都可能的
我见过这样的基因 这说明这两个基因是在一个operon上吧 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 7 你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor（DNA)到RNA的3'端，
然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
5'RACE也可以用这个方法做
我试过这个方法的3' RACE，还蛮方便的
因为我做的原核，没有poly-A tail，没有kit可以用
这个方法帮了我大忙
“5 |
|
|
w***a
发帖数: 4361 | 9 俺正好用过这个pGEX-2TK, 它这个Kinase recognition site不是酶切用的，Thrombin的
切点在旁边的位置。
如果原核表达出来的蛋白，需要同位素标记的话，可以利用这个Kinase识别位点做in v
itro kinase assay。如果你表达GST-fusion蛋白的目的是为了检测这个蛋白是否能被某
个kinase磷酸化，那就不建议用这个载体，否则就无所谓。因为用Thrombin可以把所有
的无关序列都给切掉。 |
|
m**z
发帖数: 787 | 10 用BL21做克隆？不太可行吧？克隆应该还是在DH5a等类似的里面。在这些e.coli里面没
有leaky expression的问题，只有BL21才有这个问题吧
DE3
（2 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 11 同意楼上，试试DH5a， TOP10等菌株。 过了这一步才能确认是不是对细菌有毒性。 |
|
H****s
发帖数: 301 | 12 I have tried DH5a/Top10/XL-1blue and it did not work neither.
I am very sure that there is no problem with my cut vector because I used it
to do library of huge size and never got any problem. I routinely use this
vector and same restriction sites for library cloning and never failed.
To make sure it is not cloning problem, I also did another control ligation.
Using the same materials, I ligated GFP fragment into the vector and got
tons of green colonies after induction. From the GFP control exp... 阅读全帖 |
|
m**z
发帖数: 787 | 13 you vector is clean cut, but what about your insert? In these strains, there
shouldn't be any leaky expression...
it
this
ligation. |
|
H****s
发帖数: 301 | 14 I cloned the same insert into mammalian expression vector (same restriction
sites) and did not get a problem, which indicates the insert is clean cut
too. In addition, the quality of insert was check by agarose gel
electrophoresis.
there |
|
C***N
发帖数: 200 | 15 载体的酶切位点是否是甲基化敏感的？建议在dam-的E coli里提载体，再酶切，连接。
DE3
（2 |
|
g*****y
发帖数: 6325 | 16 克隆是不能用bl21(de3)的。这个菌株有end3基因表达, 你用来测序的miniprep DNA很
容易被这个酶降解。推荐卖
bl21(DE3)gold. 这个菌株end3已经knock out了。
DE3
（2 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 17 你用的啥载体啊？ 比如PET有几个常用的载体，比如28a，30a，32a等，都试试。 或者
比如你用32a，可以先试试连到32b，32c里面，然后做亚克隆。
乱说的。 尝试一下也无妨。 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 18 "比如你用32a，可以先试试连到32b，32c里面，然后做亚克隆。"
这个实验应该可以确认到底是不是leaky expression导致的了。
应该做一下 |
|
s********n
发帖数: 2939 | 19 你可以试试pETcoco载体；实在不行就换其他的promoter，比如如pBAD。 |
|
s********s
发帖数: 67 | 20 如果毒性这么强，克隆的片段应该是一个酶吧？做几个突变试试？ 我以前碰到过毒性
蛋白，但和你的情况不一样，我是诱导之后宿主马上不生长，各种低温条件都试过。
DE3
（2 |
|
h**********8
发帖数: 650 | 21 猛男，你先用TOP10搞清楚质粒，再去BL21表达蛋白
DE3
（2 |
|
n***w
发帖数: 2405 | 22 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
我设计了一个质粒，想表达一个fusion转录因子。但是从sds－page上来看，没有
overexpression的迹象，但是做wb，用该转录因子的抗体可以看到条带，虽然不多。用
gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段，也就是说，表达的蛋白被
chop了，即使bl21是protease deficient的。。。
现在都不知道怎么办，应该用病毒表达这种full-length的？ |
|
m******5
发帖数: 1383 | 23 该转录因子多大，你试过哪些质粒
常用质粒都轮一遍，常常就能出奇迹
还有，试过不一样的培养基么 |
|
n***w
发帖数: 2405 | 24 嘿，是你。
转录因子，连上fusion的部分，就2.4kb。
我就连在了pGEX-2T系列上，因为要做表达用，当然还用过TA vector。。。
培养基一开始用LB，后来照manual里用了YTA，其实和LB差不多。。。
我大概知道是什么原因了，我想换真核表达系统试试。。。
谢谢。 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 25 该转录因子多大，你试过哪些质粒
常用质粒都轮一遍，常常就能出奇迹
还有，试过不一样的培养基么 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 26 2.4 kb够大的了 …………
很多pGEX不work的东西放到pet28a里work得很好
另外，你如果能拿到主带只是很少的话建议全程低温(18c) |
|
|
w**t
发帖数: 52 | 28 我遇到过好几次用Ecoli表达真核蛋白都是truncation，
应该是codon bias的问题，用Rossetta能好一些。
或者换insect cell。 |
|
n***w
发帖数: 2405 | 29 can you recommend some companies?
Thank you. |
|
h**********8
发帖数: 650 | 30 你的问题我遇到过，几乎一模一样。
用的rossetta, 换了个培养基2yt，温度降到20度， iptg 降到0.2, ok 了。 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 31 现在在国内，直博，第两年半，现在手头一篇做转录调控的文章在投稿，基本能保证毕
业了。
老板两年不来实验室了，实验室也快关闭了，没啥钱，靠国家补贴的每月1000大洋勉强
度日，这样混下去就是浪费青春了。
对原核表达，基因转录调控，miRNA几块比较熟悉。
想找个美国实验室的RA，做cancer方面的都可以。 此外现在对from gen to social
behavior或者disease这一块比较感兴趣，不过没啥基础。 大约可以做2年左右的时间。
希望能给个基本生活费+餐旅费就可以了。各位有啥好推荐的吗？ 还是我最好自己去了
解一些实验室，然后联系老板本人？ |
|
h***e
发帖数: 146 | 32
非常感谢 这个是做真核细胞的 有没有做原核的 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 33 和原核mRNA不一样，真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则，所以同一条mRNA翻译
出不同的产物很常见（即使不存在IRES的情况下），尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。
首先检查一下，你这2个AUG，是否都符合Kozak consensus规则，简言之如果-3位为A且
/或+4位为G的话，那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大，这样的AUG如果在5'UTR 区
域中存在甚至还不止一个的话，那么自然对正常的ORF翻译有竞争性（核糖体）的副作
用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。 |
|
W****C
发帖数: 1937 | 34 真核的蛋白在原核里表达没活性很常见吧， 多数跟蛋白修饰， 折叠， 辅助因子。
。。有关 |
|
p*****m
发帖数: 7030 | 35 这个 你看看早些年的科幻小说就知道了 呵呵。。或者你简单类比一下 砷基生物那可是
高于界/life之上的发现了 你想想第一个发现动物 植物 原核生物等等的是什么级别的
贡献 呵呵。
当然了 nasa那个Paper基本等于什么也没说 严格来说只能说发现了一个能忍耐高浓度砷
环境的生物 并没有证明真的是砷基的
FBI说的这个外星人，长得像人不说 穿的衣服还是大众典型图景中的外星人模样（金属
质地的飞行服blabla） 要真是外星人那就见了鬼了。地球上隔个大洋人长相还差那么多
呢 多少光年以外的生物会跟人一样？当然了，也还是有可能一样，这样的话这种发现从
生物学上就没啥意思。也许可以偷学点基本的宇宙航行技能。。。（嗯 这种外星人也不
咋地 遇到个雷达就掉下来了 也就比人类好点。。） |
|
a********k
发帖数: 2273 | 36 实际应用很大的，无数channel的blocker都是靶点，而且膜蛋白很多都不用考虑进细胞
的难题。一公如果盯一些重要的receptor或者GPCR做药物scientific的角度而言还是很
有钱途的，不过那样缺少CNS政治前途堪忧。现在都是靠短平快做原核的一些膜蛋白，
你也可以argue作为致病菌的靶点之类的，其实个人觉得价值有限。 |
|
T**********t
发帖数: 1604 | 37 这个不是google一下就出来了么？Y-PER是提Yeast protein的，B-PER是提baterial
protein的。肯定不一样啊，一个真核一个原核，能不能换着用还真没试过。 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 38 估计你做的这个gene甚至物种是没有已知的基因组序列信息的吧，否则你也就不会费劲
做RACE了。
把你的编码产物比对一下近缘物种的基因组序列（如果有全长cDNA序列当然最好），蛋
白质的N端往往是比较保守的，根据近缘物种的ortholog可以很大程度上帮助你确定5'
端起始位点。
如果你确定你拿到了完整的5'端序列（包含UTR），那么根据Kozak规则，ORF里第一个
符合Kozak规则的ATG就很大可能是起始ATG。真核mRNA不同于原核mRNA，基本不存在什
么RBS序列的概念，5' mG cap就是核糖体识别和结合的位点，然后往下游移动遇到合适
的ATG就开始翻译了（至少我当年上医学分子生物学的时候老师是什么说的，呵呵）
如果你不确定你是否获得了完整的mRNA 5'序列，那么继续吧，至少先通过NB等方法确
定一下可能有几个转录本，最长的转录本有多大。因为alternative splicing等等因素
的存在，一个基因存在多个翻译起始位点确实很常见，这也是基因表达调控的一种重要
方式了，遇到这种情况，你可能需要在5' RACE的引物设计上下点心思，用来区别不同
的mRNA产物。 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 39 学习了
谢谢
一直做原核的蛋白
对于posttranslational modification不熟：）
借问一下
如果一个蛋白怀疑有糖基化修饰
第一步该怎么验证呢？ |
|
W****C
发帖数: 1937 | 40 很久没做原核了， 谁推荐个质粒吧， ｅｃｏｌｉ里表达一个２００个ＡＡ的病毒蛋
白， 之后要纯化蛋白。 需要表达效率高， 容易筛选， 可调控。 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 41 请问你这是据哪里的所知？因为我问过熟人，说用的就是一个东西，但是你自己能不能
用的好就是另一回事了。我还专门让他们帮我做了个demo，和我自己做出来的基本差不
多。当然客服可能会和你说他们有什么秘密软件一般人我不告诉他，那就另说了。
DNA2.0在原核上据说是最好的，不过在真核上，个人受经验人士推荐更倾向geneart |
|
g*********d
发帖数: 233 | 42 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色... 阅读全帖 |
|
i*****r
发帖数: 65 | 43 学生物的你伤不起zz 应个景（转）~~~
高考之前流传一句话“二十一世纪是生物的世纪”从此就跳进火坑了有没有！！！！！
考得比谁都高学得比谁都苦考了笔试考实验最后收入比谁都低！！！有没有！！！！！
一进大学就开始狂背这辈子除了考试就用不到的东西有没有！！！！
鸟适应飞行的进化十大特征！ 三碳循环！二十个氨基酸中文名！！！！！
英文名！化学式！化学结构！性质特征！
最变态的还有代谢途径 ！！！！！
氨基酸有多少种代谢途径有没有！
背什么生糖氨基酸 生酮氨基酸 生糖兼生酮氨基酸！！！！
你以为生完酮就完了？根本没完！还有分解转化！
转成糖有没有！转成脂肪有没有！
不要以为吃了蛋白质不吃脂肪就不会长胖有没有！蛋白质可以转化为脂肪的！
你以为把氨基酸代谢背完了就完啥了！没完！！！！！！
还有糖代谢！糖氧化！糖酵解！脂肪代谢！脂肪酸代谢！核酸代谢！有没有！
DNA完了RNA RNA完了rRNA, rRNA完了mRNA，然后RNAi！！！！！
你有完没完了！！！
原核遗传学完，还有真核遗传！
这还只是一门课有没有！！！！！
你说学生物的人不正常！背下来这么多没用的东西还能正常么！！！！
学GRE的... 阅读全帖 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 44 一般公司都可以提供rational antigen design的服务，从序列中特征性选取多肽片段
然后交联到BSA等载体蛋白上再制备单抗或多抗。如果目标蛋白是有三级结构信息的，
这种表位预测+多肽免疫的成功率很高，一般在70%-80%以上。即便没有高级结构信息，
有经验的设计分析人员也可以将成功率控制在50%左右，一般而言选取2-3条多肽序列就
能至少有一个能制备出不错的抗体。我们这里有core facility专门提供这种服务，这
个技术本身应该说很成熟了。
自己原核表达纯化蛋白的部分片段自然也是一个选择，以前大部分人都不纯化而只是切
胶直接免疫，取决于你要做什么样的staining了，要求抗体特异性好的，就不建议这么
做了，光做western的话还凑合。 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 45 所以我说前提是能获得相似活性的产物啊，如果活性不行，那自然还得真核表达。
举个最简单的例子，重组人干扰素，早期都是大肠杆菌表达，后来真核表达发现活性提
高一千倍有余，dose啊副作用啊显著降低了，那显然用真核表达的好。即便如此，目前
原核表达的一样卖的很好，成本这东西，企业的命门
不过07年国内新版药典颁布后，以后CHO都不让用了，郁闷了一大帮 |
|
a*******a
发帖数: 4233 | 46 不知道，挺保密的
已知的一点消息似乎是和李劲松组合作
多半是讲tet family在受精卵雌雄原核甲基化水平改变中的功能。
去年有篇pnas报道过这个现象
以上系个人猜测 |
|
h*****t
发帖数: 103 | 47 注册三天了，终于可以发帖子了。无事不登三宝殿，平时我都是只看帖不回帖，保持中
华民族的传统美德，穷则独善其身。
来美国几个月了，但是对于这边的实验室，还是有些心存不甘，来一趟美国不容易，每
一天都当成最后一天，希望能够多学一些，早日学成回国。儿不嫌母丑，狗不嫌家穷，
无论走到哪里，海那边才是我永远的家。
但是现在的问题是，实验室太悠闲了，没有多少活可干。文献也读了一些，堆起来可能
接近一个人高吧，我觉得这可能还是远远不够，所以还在继续读，不过主要还是集中在
免疫、肿瘤和纤维化这块。
很想换一个能让我从早忙到晚，7*24那种的实验室，希望实验室有比较充足的经费，也
有已经获批的protocol（尤其是涉及到动物实验），方向主要在免疫细胞发育与肿瘤。
不知道这样的实验室有没有，大家可以帮忙推荐下吗？
本人会的实验不算太多，常规的实验手段，比如分子克隆（原核、真核表达载体构建与
transduction，或者病毒包装与感染）、蛋白相互作用（Co-IP、Y2H、FRET）、蛋白检
测（WB、IHC、IF和流式）、活细胞工作站（Confocal）、病理学（染色与阅片）、小
鼠尾静脉注射与皮肤移植... 阅读全帖 |
|
X*******0
发帖数: 134 | 48 某原核蛋白,在其原来的菌里的定位未知,蛋白序列本身找不到信号肽.
在大肠杆菌里表达.由于胞质表达总是包涵体,于是改周质表达.用的是pET26b,就是N端
加了一段pelB信号肽的.问题来了,表达完的蛋白去哪儿找?用哪部分纯化?是用细胞,还
是用培养基上清?问题等价于,蛋白(46kD)会不会大多数穿过细胞壁漏到培养液中.
做生化的,大量提蛋白解结构的,比较容易解答我的问题. |
|
i****g
发帖数: 3896 | 49 不一定所有人做研究发文章都是编，骗，有些就是激动人心的重大发现，连自己发现时
都会激动不已。没觉得晓东讲饶毅的成果是昧着良心，至少在他那儿地位没必要这么做
，你不相信有可能是你自己不是该领域的，没认识到其重要性和可能的影响。至少我们
投CNS文章时对每一句话及conclusion都是非常谨慎仔细的，reviewer对文章的论述和
结论的程度把握的也是非常严格的。
反而关于施一公的不少研究成果的新闻有over的嫌疑，研究的都是原核生物的膜蛋白，
硬要和疾病制药这些联系起来倒觉得牵强。
版大这样说不好吧
这个版上的一些被捧的id的文章以及某些人争相传诵的某些人的文章，当然也包括我自
己的某些文章
大家自己扪心自问一下，不说是垃圾中的垃圾，被称作“垃圾”论文也没什么过分的
把垃圾论文当混口饭吃也没什么可耻的
但是把垃圾论文混口饭吃当作神圣的职业并为之辩护就有点说不过去了
说实在话，看晓东吹嘘饶毅回国转型成功，发表若干具有重要“科学意义”的论文的时候
我都有些吃苍蝇的感觉
一些搞噱头的概念，你装作信，我装作信，reviewers装作信，editors装作信
也没什么，大家在混口饭吃的同时要能... 阅读全帖 |
|
l*h
发帖数: 4124 | 50 柯贝：对转基因的无知与偏见
发布时间:2011-07-24 09:52 作者:柯贝 字号：大 中 小 点击:1249次
相比于完全不懂生物学、用简单的“人文关怀”来反对转基因的人，一些戴着生
物学“帽徽”的所谓专家，他们的欺骗性更大。
近年来，中国比较关注转基因技术和食品，与此同时，也出现一股反对转基因的势
力。看看一些反转基因人物的所作所为，或许能够帮助人们免受误导。
美国对食品安全的要求远远高于中国。但是反转基因在中国造成的后果是：美国已
经多年种植可以食用的转基因植物，而中国迄今却不能。美国人食用转基因食物也已有
多年，有些人则是直接食用。因为美国饲养的动物普遍食用转基因作物，因此更多的美
国人间接地食用了转基因食物。美国科学院明确指出转基因食物没有对人的健康产生不
良影响，美国政府明确规定食物不能标示是否转基因，这使得民众能够同等地对待转基
因和非转基因的食物。
中国对于食品的安全要求低于美国，为什么在转基因方面的要求却大大高于美国呢
？是中国在转基因方面比美国高明？显然不是。
一个重要原因是：反转基因的势力在网络和一些传统媒体上误导了国内舆论，阻碍
了中国转基因技术的发展和应... 阅读全帖 |
|
