m*r
发帖数: 602 | 1 我没做过你这个实验，不过我用过P32，而且我觉得"老板娘"的方法并不会让你吃太多
放射。P32标记后绝大部分放射性都没在DNA或蛋白上，你电泳后让小分子同位素跑出胶
，缓冲液倒掉后胶上残余同位素应该很低了。如果你再用sheild，你身体受的辐射可能
比晒太阳受到的辐射还少。当然，手受的辐射要多得多，但这个剂量的辐射不会对手有
伤害。同位素实验主要的危险是同位素进入体内。至于拿P32胶穿堂而过，我没觉得有
什么问题，因为绝大多数胶都不怎么hot，再加上短时间接触，实际辐射不会比背景辐
射高多少。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 2 前面那些我不知道，不过蛋白修饰啥的改变表观分子量很正常
60KDa |
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k******0
发帖数: 1073 | 3 糖链修饰或超强输水，都引起表观分子量异常。
非变性胶，不是用来测分子量的。
检查抗体特异性如何或是否目标蛋白质发生降解或切除信号肽，等等。 |
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V********n
发帖数: 305 | 5 个人建议：
１）搞个蛋白电泳看是否有两种肽，没有抗体就加Tag。先搞清楚是否有问题存在。
２）如果确实有两种肽，分析未表达的序列里面的氨基酸组成。重点是磷酸化位点，疏
水氨基酸等，找线索分析功能差异。
３）造成上游AUG不能１００％利用的原因很多。比如不在最佳Kozak consensus里，
IRES，上游AUG所在位置有特殊高级结构等等。
总之，先要确定问题是否存在。 |
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a*****a
发帖数: 32 | 6 你是指增大formamide的浓度？
不知道这个会不会导电？会不会导致电泳的时候样品进胶不好？ |
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b*******6
发帖数: 39 | 7 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
条件反复重复。
1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
间再切。
2 用的内切酶是Fastdigest系列，据称内切时间很短，所以我们一般都只切3个小时，
像Bamh1也不能且很长时间，因为有信号活性，最开始还以为是Bamh1星号活性导致的。
3 后来就在pQE8的Hind3位点插进去了一段几百bp的片段，构建好的克隆载体，先用
Bamh1切（因为Hind3有2个），再用Hind3切，用Bamh1切可以看到质粒线性化，再用
Hind3切可以看到切下来的片段。所以质粒酶切应该没有问题。
4 关于PCR产物酶切。当初经验不足，只在引物两端加了3bp碱基而不是4bp，但是查了
酶切位点表，3bp对各个内切酶都已经足够了... 阅读全帖 |
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n********k
发帖数: 2818 | 8 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
条件反复重复。
1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
间再切。
Nice alternative, shall solve the problem in this case...but I would just do
blunt ligation, nowadays, the fast ligation kits from different companies
such as Roche, takara, don't really care about whether it is sticky or blunt
ends, it works just as well...BTW, any one else ... 阅读全帖 |
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a********n
发帖数: 844 | 9 如果lz在讲附上的胶，我的看法是：
1.上面那个带是well里边滞留的，下面那个是free CTP还是free RNA不好说。但整个胶
曝光时间不够长。我做过无数EMSA，也是RNA aptamer，RNA 从MAXIscript得到后不用
纯化，直接取1 ul去跑denaturing gel，看看有没有transcripts，产量有可能因为变
化的，所以每批都要检验。我组里有个博后不信邪，在这上面浪费了几个星期，一直以
为是这个那个仪器不好用。
2.lz提到protine minus也有多条带，这在native gel里边太正常了，因为RNA有多种
folding的可能性，即使mfold只给出一种结构，我在胶里也能看到很多条带。蛋白特异
性的带可能跟RNA一下带superimpose，但是你会看到下边一条带变弱，上面一条带变强
，这样你要换种浓度的胶跑跑。
3.制胶和电泳液可以用1/4xTBE或者1/2xTGB，前者我用的比较多，这个每个蛋白性质有
关，一般都要试试。
4.ARGA胶有些时候可以替代page，想B52的RNA APTAMER只能在ARGA胶才能看到shift，
原因不... 阅读全帖 |
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b******n
发帖数: 4225 | 10 发现过用自己配的loading dye，如果pH没调整好
会引起DNA的电泳行为发生变化
比如本来1.2k，跑出来800bp
那种有双带的可以用商用loading dye上样重新跑一下 |
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Q*****n
发帖数: 4546 | 11 想试试体外表达一个蛋白，自己按人家paper做的E.coli extract，（kit太贵了），试
了一下好像除了本来的那些条带，电泳上没看到什么新的随着时间会增强的带。应该是
什么地方搞错了，哪位有经验的能否点一下哪些地方要特别注意的。 |
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f********n
发帖数: 6465 | 12 生物实验的绝大部分都是这样啊.
提质粒跑电泳之类的. |
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p****p
发帖数: 3360 | 14 跑胶需要那么长时间的话，应该可以降低胶的浓度吧。
用普通Native PAGE加urea有什么问题么？核酸电泳用不用urea的PAGE都是一个配方。 |
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m**z
发帖数: 787 | 15 is the DNA marker double stranded? |
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o********y
发帖数: 87 | 16 Run denaturing agarose gel |
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t*****z
发帖数: 1598 | 19 谢谢楼上各位，尤其是Chamgrape的方法，如果真的管用那太好了。我今天试了下一个
total RNA。一条亮带在0.8kb，一条暗带在1.4kb，乘以2之后勉强接近18S和28S的大小
了。粗略定量也许可以吧。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 20 sonication的设置被人改过没注意到，在dilution buffer（也就是immune
precipitation 反应的buffer）里取了一部分跑电泳，发现genomic带很清晰，smear分
子量都很大，并且很黯淡，这种情况下能在dilution buffer里紧急大功率补sonicate
一下么？非常感谢！！！！ |
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V********n
发帖数: 305 | 21 多谢。
这个蛋白一般情况下在膜上均匀分布。刺激后聚集。我尝试过刺激前后的细胞抽提膜蛋
白，然后IP，跑电泳，银染色。可惜没有特异性东西出来。如果CROSSLINK，不知道能有多大改善。
IF图片里现象很明显。每次我和老板都对着图片感慨，要是能一刀把聚集区切出来就好
了。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 22 刺激前后的细胞抽提膜蛋白，然后IP，跑电泳，银染色。可惜没有特异性东西出来
——这个不奇怪吧，如果蛋白表达什么没有变化只是位置变化了的话
我觉得可以试一下crosslinking
好好选择spacer distance
平时蛋白均匀分布，大概距离多远
选个比那个距离小的spacer
富集的时候就应该能crosslink上了
不过如果蛋白富集区有很多种不同的蛋白的话
分析起来会比较痛苦
也可以选择带s--s的可以reverible的crosslinker
这样跑变性胶就能看
不要做MS
能有多大改
善。 |
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d*******s
发帖数: 61 | 23 好像SDS和等电点的二维电泳数据比较多，不知道BN/SDS gel的数据库在哪里。请有经
验的介绍一
下啊。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 24 我用两种 Kit，Clontech 的 BAC100 和 Qiagen 的 Maxiprep，纯化出来的 DNA 纯度
都不如 CsCl 的高。我用 CsCl 纯化的 BAC 放很久都不会有降解，跑电泳也不会看到
smear，但是 kit 纯化的 DNA 就不行，放两三个月跑个胶就能看到降解的 DNA smear
了。 |
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d*******i
发帖数: 472 | 25 PCR产物刚刚跑出胶孔就不动了，但条带形态很好
1，把marker和样品点在一个孔里面，marker完全正常，样品还是异常
2, 所有primer组合都出问题了，出事之前都是用的好好的primer
3，公用药品缓冲液都没有动过 |
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C*********u
发帖数: 811 | 27 loading dye的问题吧
PCR产物刚刚跑出胶孔就不动了，但条带形态很好
1，把marker和样品点在一个孔里面，marker完全正常，样品还是异常
2, 所有primer组合都出问题了，出事之前都是用的好好的primer
3，公用药品缓冲液都没有动过 |
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q*******8
发帖数: 768 | 28 什么PCR啊？不会是质粒吧。。。然后没P出来，就看到大质粒了。。。 |
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f***k
发帖数: 143 | 29 Do you have protease K in your lab? Try to digest you reaction product for a
short while. Your PCR product might be aggregated with protein. If this is
the case, that means your starting materials (likely the template, either
plasmid or genomic DNA) contain a lot of protein. |
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s******s
发帖数: 13035 | 30 second this
估计用错了dye, 比如用了蛋白dye? |
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d*******i
发帖数: 472 | 31 谢谢各位的热心回复
换了隔壁实验室的PCR酶和引物
暂时搞定，正在试换一个的情况，看看能不能确定原因 |
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W*********n
发帖数: 775 | 32 最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品要多少ug, 才能够得到比较理想的检测结果？
20ug蛋白一般需要多少胰蛋白酶来降解？
3）大家一般会加入什么样的磷酸酶抑制剂来抑制磷酸化？
谢谢! |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 裂解的时候，先把细胞用dPBS洗一洗
既然你要跑总蛋白的胶，那何必用TCA沉淀呢？直接用8M Urea 裂解然后
直接上胶不更好么？这样还省得你操心phosphotase 的问题。
另外，如果你自己没有做过trpsin digestion, 不如让跑质谱的人帮你做算了。
他们一般都负责这一步的。你要自己做，万一没弄好还更麻烦。
最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品... 阅读全帖 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 35 是这样啊。可是我刚刚抽提好的质粒，是没有这一条带的，放上几天才出现。是否放置
本身也会让质粒变性呢？
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s******y
发帖数: 28562 | 36 会。
至少有两个可能性：
1。完整的双链环状质粒是很稳定的，但是大质粒在提取的时候容易受损，
可能会在其中一条链上有缺口什么的，放在水中就慢慢会被降解。
2。提取的时候蛋白没有去干净，可能有少量核酸酶残留。特别是如果最后的
溶液里没有加EDTA的话就很容易被降解。 |
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v*******3
发帖数: 119 | 37 CHIP已经作了块3个月了,
全程基本自己摸索
用的是cell signal chip kit及抗体,新鲜
问题一直在:
预实验作了很多,IgG (negative control) and H3(positive control) 有显著差异,
但是其它磷酸化组蛋白与转录因子均与IgG类似或者持平或更低
2. 实验用的是 1% formadehyde固定10分钟,全程按照kit说明书来,而且适当改进重要
步骤(如 increase cross link reverse time, 减少洗得次数)
3. 用的都是全都是cell signal 抗体, 并在非 cross link情况下，用WB证实可用
4. sonication后电泳证实DNA片断200-1000 bp间,符合要求，无气泡
所以现在我自己的猜想:
1. cross link mask the epitope of antigen, resulting no antibody binding
2. 1% formadehyde is too low, should increase to 1.5 or 1.8 %(... 阅读全帖 |
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s*********y
发帖数: 387 | 38 求好的做蛋白质谱服务的公司
我只提供ＰＵＬＬＤＯＷＮ的电泳胶，他们负责左右的后续工作！ |
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s********n
发帖数: 2939 | 40 一般的实验可以用2-3次吧，如果比较重要的就还是用新的啦。 |
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d******y
发帖数: 11545 | 41
thanks. 就是跑胶看一下,连western都不用做. |
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m**z
发帖数: 787 | 42 一直反复用很多次的。。。当然也不是western. |
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g*********r
发帖数: 9366 | 43 有次数限制的
我有一次就用了太久导致跑坏了
现在一般用两三次就扔 |
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s******s
发帖数: 13035 | 44 现在都是小胶，没啥可惜的。以前大胶一次1L+的，可以考虑留着 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 45 inner（上层）buffer应该倒掉，tank里面的可以用2-3次的 |
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c********r
发帖数: 6013 | 47 不建议重复使用，也没多少钱，但的确影响条带的形状，特别是大胶。多花点钱，省时
间，再说老板会关注你省了多少钱吗？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 48 原理不知道，Invitrogen的MOPS电泳液的瓶子不是避光的，越放颜色越深，估计和环上
的氧化有关。 |
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T********e
发帖数: 223 | 49 不过这电泳图有必要ps么？真存心作弊的话，想要什么带重新跑一个就是了。 |
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y******n
发帖数: 8667 | 50 DNA太多了，黏糊糊的一团，大家都是怎么把样品放入电泳槽里的？ |
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