T**********t
发帖数: 1604 | 1 那你跑中性的非变性胶就够了吧，Histidine-MOPS的那个，pH 6.8左右。你的蛋白pI那
么高，肯定能跑得开的。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 2 恩，我可能还是跑醋酸的那个，我有4个蛋白，分别是7，8，10，11
再次感谢！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 3 醋酸那个pH太低了，碱性蛋白跑得太快分不开。我的蛋白pI大概9.9的样子，用Acetate
-beta-Alanine pH 4.3的跑，单体和dimer紧挨着一团。用Histidine-MOPS pH 6.8的跑
，就能看出来两团，虽然也还是团，不是条带，但至少是分开的两团。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 4 好的，那我先试试看histidine-MOPS pH 6.8的
想问你一下你用什么loading buffer呢？
我不确信BB和XC在反接电极的条件下是不是和蛋白一个方向移动
Acetate |
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 loading dye 用methyl green
其他的就跟别的loading buffer成分差不多，就是stacking buffer加上甘油。 |
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l**n
发帖数: 109 | 6 polarizer没法可靠区分吧。
最好还是uv荧光显微镜，或者捞晶体跑电泳，或者X-ray |
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i***a
发帖数: 11095 | 7 n多年前做过，应该挺简单的
若是30bp的话
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如上图一样设计引物，中间15-20个碱基配对，两端再加上6个碱基的内切酶位点，再各
加3-4个保护碱基
正常PCR后，电泳，纯化，测浓度，各自酶切，失活，酒精沉淀，再溶，然后用T4连接酶连接
clony PCR的时候可以用primer之一跟vector上附近的一个primer试试看 |
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c****5
发帖数: 77 | 8 尽管生命科学的实验设备和平台在21世纪的第一个10年发生了翻天覆地的变化，很多领
域都有了革命性的变化，但是现代生物实验室中最常用最有毒性的试剂溴化乙淀（
Ethidium Bromide）却一直没有改变，从1950年开始用到了今天，想信至今还是绝大多
数实验室的必备品。溴化乙淀的主要作用是分析DNA，其分子可插入DNA的碱基之间，形
成一种络合物，在302nm紫外光透射仪激发并射出橙红色信号，可以用来显示琼脂糖和
聚丙稀酰胺凝胶中的DNA片断。
但是溴化乙淀是一种很剧烈的化学致癌剂，能够诱导DNA碱基突变和破坏细胞线粒体的
功能，一般实验室使用的剂量虽然很低(0.25-1.0ug/ml), 但是给实验室工作品人员带
来了很大的麻烦，使用时必须要戴手套，含有溴化乙淀的琼脂糖和用过的电泳液必须要
收集到专用的容器中保存，转运和处理，含有少量溴化乙淀的实验室污水也要确保严格
环保处理。长期一来，溴化乙淀就是各个生物实验室不得不用却叫人头痛的试剂！
最近发现2家美国生物公司出品了溴化乙淀的替代物：
1. EZ Vision是一种无毒无害的溴化乙淀替代物，敏感度高，能够辩别0.25ng浓度的 |
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y***e
发帖数: 6082 | 9 两年前还用EB。。。。现在改用GR了，的确好多了
尽管生命科学的实验设备和平台在21世纪的第一个10年发生了翻天覆地的变化，很多领
域都有了革命性的变化，但是现代生物实验室中最常用最有毒性的试剂溴化乙淀（
Ethidium Bromide）却一直没有改变，从1950年开始用到了今天，想信至今还是绝大多
数实验室的必备品。溴化乙淀的主要作用是分析DNA，其分子可插入DNA的碱基之间，形
成一种络合物，在302nm紫外光透射仪激发并射出橙红色信号，可以用来显示琼脂糖和
聚丙稀酰胺凝胶中的DNA片断。
但是溴化乙淀是一种很剧烈的化学致癌剂，能够诱导DNA碱基突变和破坏细胞线粒体的
功能，一般实验室使用的剂量虽然很低(0.25-1.0ug/ml), 但是给实验室工作品人员带
来了很大的麻烦，使用时必须要戴手套，含有溴化乙淀的琼脂糖和用过的电泳液必须要
收集到专用的容器中保存，转运和处理，含有少量溴化乙淀的实验室污水也要确保严格
环保处理。长期一来，溴化乙淀就是各个生物实验室不得不用却叫人头痛的试剂！
最近发现2家美国生物公司出品了溴化乙淀的替代物：
1. EZ Vision是一种无毒无害的溴 |
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m****M
发帖数: 360 | 10 靠，哪里有那么小心呀。我都是直接到电泳液里去裸手捞胶，完了之后直接用水冲一下
就行了，那里有什么毒呀，到现在都活的好好的。 |
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b**********t
发帖数: 353 | 11 啊，我还以为美国的实验室都不用EB了呢，我们实验室用的是lonza的precast的
cassette,也不用电泳槽和电泳液啥的，直接就把cassette插上电，就跑就行了，三两
分钟就跑完了，而且跑的时候直接肉眼就能看到条带，也用不着UV啥的..... |
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h*****d
发帖数: 210 | 12 EMSA 新手，求教高手以下问题。
我从种子提nuclear extract, 想做EMSA, 用的是DIG-Gel shift kit. 开啥有了
TATABOX （5 repeats) 25bp in length, 试试看蛋白是不是有功能的，结果没加蛋白
的free probe也有带，所以认为我那加了蛋白后产生的带不是真的binding，因为2 带
的位置是一样的。但是有些情况用其他大一点的探针，50bp, 会得到smear. 还有我跑
电泳的胶很小，8x8cm（bio-rad)， 5% native gel. 0.25x TBE buffer, 4C, 80V.
问题：
1）怎么能证明蛋白是用功能的？现在没有binding， 不知是不是蛋白的原因，SDS-
PAGE 检测蛋白还行。抽的几次都是结果差不多，尽管有些带很强且集中在2个区段，但
总体来讲，蛋白的分布大小都有。
2)能不能找个其他probe 做postitive control。 有人可以推见一下啥探针？
3）我是用的nuclear extract, 探针可不可以用200bp 长的。
4)调整些啥才能有好的bindin |
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m***o
发帖数: 272 | 13 我用HA做为no antibody control because IgG background is too strong。如果以HA
来normalization，我做的TF binding 有显著差别。而我的TF binding如果用 % input
则差别很小。现在的问题是，不同sample 的HA 总是有差别。怎么来消除HA binding
的差异？是不是样品的处理造成？用的细胞是分化组和未分化组。两组蛋白含量差别特
别大。不知相同细胞数超声，但是蛋白含量可以差10倍，是不是超声条件也该不同？但
是电泳看，大小差不多。请高人指点迷津。谢谢！ |
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w***a
发帖数: 4361 | 14 这两件事俺当然知道，俺还跟着灌水呢。
但这都是集体力量，而且也就是WSN们跑电泳的间隙，顺便打个酱油。木有人整天正经干
这个事啊。成功率确实高，但是样本数也太低了。
方肘子早期不招人嫌弃的时候，那成功率也是灰常高的。 |
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e*******n
发帖数: 2178 | 15 最近做个克隆，做了两次，不成功。今天check一下问题在哪里，发现很奇怪。
质粒先内切酶处理，然后胶回收，取出5微升，得到sample 1.
然后用New England的Antarctic Phosphatase处理半个小时，取出5微升，得到sample
2.
然后65度5分钟灭活，取出5微升，得到sample 3.
电泳发现sample 1和2都有DNA条带，很明亮，sample 2稍弱，但是sample 3就啥都没有
了，连很弱的条带都没有。有TX知道这是什么问题吗？ |
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e*******n
发帖数: 2178 | 16 最近做个克隆，做了两次，不成功。今天check一下问题在哪里，发现很奇怪。
质粒先内切酶处理，然后胶回收，取出5微升，得到sample 1.
然后用New England的Antarctic Phosphatase处理半个小时，取出5微升，得到sample
2.
然后65度5分钟灭活，取出5微升，得到sample 3.
电泳发现sample 1和2都有DNA条带，很明亮，sample 2稍弱，但是sample 3就啥都没有
了，连很弱的条带都没有。有TX知道这是什么问题吗？ |
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v***a
发帖数: 1242 | 17 就我的理解（包括从网上抄的）：
EDTA是：
1）蛋白质变性剂和稳定剂。
2）金属鏊合剂，螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子（防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防
止Mg2+离子与核酸生成沉淀），抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需
要一定的金属离子作辅基）。
3）有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 18 我大约在200ul体系里面加了几十ug的质粒，按理不算多了。
我也这么想的，在中间克隆一个2-3kb的片断进去，再利用分子量的差异回收。理论上
可行，但实际操作上还有困难，因为没有切开的质粒电泳是不按线性质粒规律的，跑得
要快一点，说不定也就赶上切开的质粒了 |
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t*******k
发帖数: 87 | 19 困扰很久了，想请教做ubiquitin的大牛：
把纯化的ubiquitin单体SDS电泳，考染一条带没问题，但用ubiquitin抗体做western，
总有一条大小为diubiquitin的条带出现，关键是这个条带在后续的pulldown实验中被
富集，不知道ubiquitin是不是能够自动聚集成多体啊，可能是非共价连接吗？谢谢 |
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F******y
发帖数: 1988 | 20 一般情况下蛋白电泳都用Tris-Glycine buffer system
低分子量蛋白（10kD一下）一般推荐用Tris-Tricine buffer system
有没有用过这种方法的筒子们上来说一下，能有详细的protocol，kit catalogue等的
最好，没有的话讲讲实验tips也好。
包子奉上，小生在此有礼了。 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 21 以前都是跑胶之前，100度5-7分钟，都没有问题
最近好几次都出现样品一煮胶就跑的乱七八糟的现象
同样一个样品，没煮的时候跑了一次胶，然出来，条带清晰，western blot出来也干干
净净
放冰箱里面过了一个over weekend (冰箱没问题），煮了再跑出来，染完胶胶就看上去和
火箭电泳一样，有comet尾巴，转的膜做western出来的都不是条带，而是一个一个的
dot
各位大侠知道是怎么回事吗？我怀疑是盐浓度的问题，可是没有理由煮一下盐浓度就变
了啊 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 22 agilent的bioanalyzer现在用的很多
的确又快用量又少
但是说白了其实也就是毛细管胶
一样是跑胶
一样是看rRNA的比例
没有这个条件的其实跑个琼脂糖电泳
照个照片
然后选择显示migrate/intensity
出来的图是一样一样的
只是没有人那样计算“RIN”而已
degradation |
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b******n
发帖数: 4225 | 23 不知道你试的结果怎么样
如果自己配的loading dye加的溴酚蓝太多的话
会严重影响pH值，表现就是loading dye显示棕黄色而不是蓝色
如果你的DNA不是溶解在TE或者tris buffer而是水中的话
这种loading dye（尤其你加的很多）的pH会影响DNA的带电状态
在电泳的时候泳动速率就不完全跟分子量相关
建议你换成商用的loading dye试试 |
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g******1
发帖数: 244 | 24 更新：跑了个琼脂糖电泳，28S 和18S条带很清楚，有少量Smear。但是5S最亮，18S 看
起来比28S亮一点。这是不是跟降解有关？ |
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C***l
发帖数: 2625 | 25 当年我们给一次性称量皿底下写上NaCl, Agarose，Glycine, SDS等，反复使用。自己
配的电泳液也至少用两次，相机和分光仪全部靠蹭。好在老板买酶和抗体从不手软。 |
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s********2
发帖数: 138 | 26 嗯，对，可能是这个问题。但是PCR产物的浓度应该不是问题，我都用分光光度计检测
过，并且用电泳法也估测了。那可能就是引物的问题了。我问一个比较弱智的问题，p
mol应该是10-12 mol吧？
有的
引物 |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 这个。。。关键是不纯的东西不好重复吧？
上一瓶和下一瓶的成分都不一样怎么搞？
还有，搞结构的实验室也得跑电泳啊，不纯的东西配出的胶跑出来没法看 |
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h***3
发帖数: 26 | 28 我的bench被安排在跑电泳的bench旁边，左手边就是那个扔胶的垃圾箱，实验室用的是
SYBR green，我查了查，也会irritate眼睛和上呼吸道，有经验的人来说说，这样的工
作环境会很不好么。。。 |
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d*******d
发帖数: 1341 | 29 实验室两个装buffer的瓶子标签不正确，一瓶实际是1倍浓度的，另一瓶实际是10倍浓
度的，我都按5倍浓度稀释的。就是running buffer浓度是实际的1/5或2倍。已经发现
跑电泳的时间差别比较大了，不知道对实验结果会不会有影响？多谢高人了！ |
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z******g
发帖数: 5 | 30
1.不知道你是不是纯化做的不多还是太矫情，从你的电泳图来看，那已经很纯了。下次
优化一下
ni column的过程，再过个Q、S，gel filtration之类的，那点杂带早就不见了。而且
你做NMR，
又不用结晶，也用不着那么纯。
2.做complex的都愁着蛋白不结合，没有人愁着结合的分不开。想分开办法多着呢，提
高NaCl浓
度，离子交换什么的都可以试试 |
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s*******e
发帖数: 17 | 31 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
抗体做western检测药物处理前后
的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
常明显。从分子量判断，这个条带
肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
不到那个70kD分子量位置有蛋白变
化。
我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 32 能reuse 几次？
还有这个buffer 在室温能放多久？
谢谢 |
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a**v
发帖数: 406 | 34 5-7 times. I also reuse transfer buffer for 5 times |
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s******y
发帖数: 28562 | 36 对。而且外槽的就要一直在外槽用，最多反复用５次吧。
室温一个星期没有问题（当然要放在有盖子的瓶子里） |
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Z******5
发帖数: 435 | 40 我们一般都是跑完后把内外液混到一起，下次做外液用。内液每次都用新的。
如果是重要实验，全部用新的。
其实就是点甘氨酸，Tris，SDS，都很便宜。最主要的是不用去调pH，配制非常方便，
1L 5X 的就可以用五六次实验。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 41 我用的是不连续buffer系统，内外Buffer不一样，所以肯定不能混起来的。 |
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w******a
发帖数: 1527 | 42 啊？你说的是running buffer 吗？... |
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w***e
发帖数: 269 | 44 we use invitrogen system, everything is from invitrogen including buffers.
we re-use the buffers a lot, like using the same buffer for a month or
longer. But the buffer needs to be kept in the fridge or cold room. |
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m*******8
发帖数: 256 | 46 最近在做某一蛋白的磷酸化实验，看了几篇文献，都是通过蛋白的迁移来做的。但是他
们在方法里对于跑胶的条件说的都不清楚，所以我想请教达人，胶的浓度，跑电泳的条
件，还有转膜需要注意什么吗？多谢了！ |
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L**********O
发帖数: 1761 | 47 实验又不顺呢。外面下雪不敢去飙车只好上来发泄一下。。
为什么文献上都说3周的induction,而我做的是第一周还有点阳性，到了第2周减少，第
3周就啥也没有了呢？是我的错吗？
没有好data,心里烦着呢。一白女同事也不知道为什么那么兴奋，跑个genotype的电泳
，就说啥的exciting~~oh gel~~~ 又放一些撞墙的音乐。。。
我承认我就酸的。。一怨妇。。大家拍我吧。。。 |
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y*****1
发帖数: 73 | 48 降解是蛋白本身性质决定, 具体可以在expasy的protparam上查estimated参数
另外你说看不到13kda的带不排除电泳已经跑没了 可以上FPLC用uv检测 |
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n******e
发帖数: 110 | 49
的抗体成分呢？
可以试试沉淀直接电泳。有时候沉淀会溶解在上样buffer里。 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 50 不如先找你的基因区域有没有micro-satalite marker吧。这些marker比SNP
informative，通常有好几个allele,
只要找三四个就可以大致确定那个区域是不是homo了。跑capillary 电泳确定长度就可
以了。sequencing core 可以做，一板96样品可能就一百块钱吧。 |
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