s***i
发帖数: 600 | 1 花了一个星期时间，
终于知道你是谁了。
失敬失敬
XXX（1972-）
男，福建人，XX大学毕业，美国XXXX大学计算机博士，现在美国工作。网名calc。
XXX发表的第一篇科幻译文就是04年译文版上的阿西莫夫旷世经典《基地》，这是他在
读博士期间利用在国内等待签证的时间翻译的。这部《基地》一出（和第二部、第三部
一起），马上就引发了震撼性的《基地》热潮。除了因为这是阿西莫夫基地系列第一次
与大陆科幻迷见面外，三位译者（另两位译者分别是顾备和阿牛）的高质量译文也起了
相当大的作用。XXX的译文务求严谨准确，又不失通畅，与原作精神契合，一定程度上
超越了台湾叶李华的版本。
《基地》之后，X博士仍时不时为《科幻世界》翻译一些中短篇作品，包括《氢墙》、
《金雕传说》、《引力矿》、《嘎嘎语之谜》，均颇受好评。 |
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T*******x
发帖数: 8565 | 4 看了你的翻译介绍，顶礼膜拜牛人。而且表示致敬。
board=Fujian&gid=3310317 |
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z*y
发帖数: 1311 | 14 最喜欢《最后的答案》
最后那一句话，真是神来之笔
相形之下，3T3显得冗长乏味 |
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a********o
发帖数: 173 | 16 谢谢！
当时只是看完了3T3，作为伪生物学家觉得第一部结尾“害虫无敌”的剧情没有展开，
于是有了这个很欢乐的idea
文笔和思维都有限，我有空尽力乱写写吧 ：） |
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t*******n
发帖数: 446 | 17 就是普通的贴壁细胞系，比如293 3T3等什么的，有什么区别吗？ flask要贵些吧？ |
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p**i
发帖数: 3525 | 18 Many thanks. Is it stronger than gelatin?
Collagan I or IV?
3T3 cells 最适合用什么呢? |
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h********n
发帖数: 4079 | 19 具体哪个细胞用那个coating的dish我不知道, 要靠自己试.
BTW, 3T3我没养过. |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 Our NIH 3T3 cells are very well adhesive even without any coating.
If yours don't still to the wall tight enough, very likely they are
contaminated with mycoplasma |
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b********i
发帖数: 73 | 21 Hi, there: May I have a question about 3T3-L1 preadipocyte differentation?
In induction medium, I will use
10% FBS, 5ug/ml insulin, 0.5mM IBMX and 1uM DEX for 4 days. Then keep in
5ug/ml insulin for another 4
days. Any difference from your protocol? |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 如果confluent 就不贴壁的话，有两个可能：
1。mycoplasma contamination
2. cell type transformation
我们是用PCR-based method, 非常简单，
很多公司有卖的，大概就叫 mycoplasma detection kit
没有好办法去除，发现被污染就就整个细胞株都扔了重新在可靠来源买一个。
我当时用这个3T3的时候，试了学校里几个实验室来源的细胞都有污染，
后来干脆从ATCC买了一个新的，反正又不贵 |
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a****d
发帖数: 1919 | 23 大家lab里面都会定期检测mycoplasma infection吗？
我们lab的最新指示是：所有的cell line，都要test mycoplasma infection every
month；我常用的293FT，HEK293，3T3 cell,从来没关心过mycoplasma，一样用得很好
，现在对于是否应该每月都花精力test mycoplasma非常怀疑。。。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 24 1. Ellinger-Ziegelbauer H, Aubrecht J, Kleinjans JC, Ahr HJ. Application of
toxicogenomics to study mechanisms of genotoxicity and carcinogenicity.
Toxicol Lett. 2009 Apr 10;186(1):36-44. Epub 2008 Sep 4.
2.Ao L, Liu JY, Liu WB, Gao LH, Hu R, Fang ZJ, Zhen ZX, Huang MH, Yang MS,
Cao J. Comparison of gene expression profiles in BALB/c 3T3 transformed foci
exposed to tumor promoting agents. Toxicol In Vitro. 2010 Mar;24(2):430-8.
Epub 2009 Oct 17.
a********[email protected]
Thanks in advance. |
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l*********i
发帖数: 10 | 25 用fugene转（英文名字忘了拼写了）。lipo毒性太大，
谢。 |
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T****r
发帖数: 4006 | 26 shRNA vector有puromycin selection? 用药晒一下...
不然就用lentiviral shRNA vector, 直接做成virus 转染.... |
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w******e
发帖数: 1187 | 27 sunnyday zhenshi shiyan baodian ... |
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a*****n
发帖数: 2835 | 28 shRNA还是做成virus比较有效，siRNA有专门的转染试剂效率很高
谢。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 29 I use lentivirus to make sure high efficiency of transfection. |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 没有办法，千老作的太久了，什么试验都作过，什么技术都知道一点，
我现在都想我是不是该出一本试验手册拿去卖了。哈哈哈 |
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s******r
发帖数: 2876 | 31 你应该开一个公司做试验。
没有办法，千老作的太久了，什么试验都作过，什么技术都知道一点，
我现在都想我是不是该出一本试验手册拿去卖了。哈哈哈 |
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w***a
发帖数: 4361 | 33 试过electroporation么？
俺电转过siRNA到differentiated adipocytes，转完以后细胞挂了一些，但剩下的
knockdown effect可以到80%以上。
谢。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 34 对，病毒最狠，
不过你貌似需要LICENSE和LEVEL II的HOOD？ |
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i***R
发帖数: 663 | 35 我用过电转siRNA，效率可达90% 以上。
操作很简单，就是需要找到有设备的实验室。
谢。 |
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T****r
发帖数: 4006 | 36 我呆过实验室，只要做细胞的，一般使用的hood都可以操作... |
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w***a
发帖数: 1053 | 37 提高lipo和质粒的ratio，多加点lipo，毒性可能大了些，但是效率会高点。
另外，试试电转，如果还不行就virus吧。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 38 请看附件上的照片（200x），不知道有多少细胞被转染了？
有没有20％？~100％ confluency
0.8 ug Plasmid DNA + 4 ul Lipofectamine 2000
转染10^5细胞。
谢。 |
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j****g
发帖数: 406 | 39 一般养在P-D-L coated cover slip上，用PBS洗两次，用4%PFA fix for 20min.
问题是PBS一洗细胞很容易缩，等到全部staining做完已经没有剩几个了。试过不同的
density好像都有这个问题。想请教一下有没有人有这方面的经验，能拿到如同culture
medium里面同样长得漂亮的细胞，谢谢。 |
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S*********e
发帖数: 127 | 40 coated the dish with ECM such as Fn |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 Easy, fixed then first, then wash.
culture |
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S*****s
发帖数: 287 | 42 你用 4% PFA fix 20 分钟是不是顺便破细胞了？如果是的话你可以考虑用 BD
Biosciences 的 CytoFix/CytoPerm。我同时染两组细胞，一组用 1% PFA fix 15 分钟
染细胞表面蛋白，另一组用 CytoFix/CytoPerm fix 15 分钟染全细胞，CytoFix 处理
的细胞贴壁非常好，PFA fix 的细胞还是很容易掉。我用的是 glass bottom dish，
poly-L-ornithine 37C 处理过夜，第二天用水洗三次。 |
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i********d
发帖数: 7 | 43 3T3-L1细胞转了lentivirus，用10ug/ml的Blasticidin筛选，现在9天了，LacZ-
Lentivirus转的细胞死的差不多了，能看见单个clone了，不过我自己做的lentivirus
转的细胞还是很多，下面该怎么办？提高Blasticidin的浓度？
或是我这个基因对细胞有保护作用？多谢指教！ |
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p******d
发帖数: 3737 | 44 不知道别人的感觉怎么样，我的3T3从来都长的慢，也没有死细胞。 |
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j****g
发帖数: 406 | 45 我的经验是不同的cell line有不同的最合适的reagent。
293T, Hela用lipofectamine／2000效果很不错
NIH/3T3用RNAiMAX from invitrogen following the reverse protocol
N2a听说roche的X-tremeGENE不错
另外DHARMACON的1，2，3，4也有很多不同的最适合的cell line. |
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D******9
发帖数: 2665 | 47 我试过3T3和MEF， 确实很低。希望做过的能提供一下有用信息 |
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m******5
发帖数: 1383 | 48 我怀疑两个蛋白的相互作用只在核成分里发生，细胞质成分会抑制其相互作用，于是计
划用核抽提物做co-ip
发上根据别人文章里方法设计的protocol，请有经验的同僚帮忙看看有没问题？
1, 10 mm 盘NIH 3T3 细胞， 用 500 ul 10mM hepes, 10mM NAcl冰上重悬溶胀
2，半小时后过针头，理论上说此时只有核完整，大多数细胞质都裂开
3，500G低速离心收核
4，等volumn高盐高甘油buffer吹吸
5，再加等总体积的低盐buffer降盐浓度至140mM， 降NP-40至0.5%
6，常规co-ip步骤
大家说这个protocol会有大问题么？这个相互作用难做，之前曾经有这个protocol做出
过很强的相互作用，但不说明protocol没问题 |
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w*******5
发帖数: 243 | 50 筛选之前要做个浓度梯度，观察2周左右，刚刚全部死亡的浓度比较好。太早和太晚都
不太好！你不做筛选就做，太牛了！ |
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