x*****e
发帖数: 309 | 1 贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
(1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和
281bp条带差异不明显，故对 |
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b******r
发帖数: 111 | 2 Anyone has experience of inserting 9kb in a 8.4kb vector? 2 months was gone
,but I get nothing. Would
you like to take a look a this protocol and give me some suggestion ?
Thanks a lot
Purpose: Insert 9kb mouse sequence into vector pPNT6.
Vector pPNT6: Its map is at http://www.addgene.org/pgvec1?
f=c&identifier=11072&atqx=pnt6&cmd=findpl . I have inserted 0.9kb DNA in
this vector at XhoI/EcorI
double sites. I should have no problem in cloning short fragment.
Insert DNA is 9kb.I have cloned t... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 3 实验流程第二步：
2. Transfection
更新前
2-1 NLS-NgAgo expressing plasmid is extracted with Wizard® Plus SV
Minipreps DNA Purification System (Promega), and is adjusted to 100 ng/μl
in 0.5x TE buffer (5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA，pH 8.0).
2-2 5’-phosphorylated ssDNA guides are dissolved to 100 ng/μl in 0.5x TE
buffer (PH 8.0). For each well of a 24-well plate, 200-250 ng NLS-NgAgo
plasmid and 100-300 ng guidesare diluted in 50 μl Opti-MEM (Gibco); 1.25 μ
l lipofectamine 2000 is diluted in 50 μl Opti-MEM.... 阅读全帖 |
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S*********l
发帖数: 783 | 4 借宝地吐一下槽，也求安慰！
我最近才转到一个小实验室，一个tech，一个临床fellow，但是在实验室呆了2-3年了
。tech为白女，很精明很bossy，fellow为犹太女，每周五在临床，其他几天在实验室
晃，没有多少实验经验，但是很能说。这两人已经共事2-3年吧，看上去很关系很好。
大家可能会说这样的实验室我也会去？唉，苦逼博后，已经EB1a拿到绿卡，但是想到东
岸机会多，而且小孩还比较小，不想太快搬家。所以在急着找位置的时候就进了这个地
方。
新实验室有不少protocol跟我以前的都有些细微的差别。比如Ficoll之后不用ACK
buffer，或者小鼠spleen 用ACK 只用2分钟（但是我看她们的flow 确实看到有RBC的
population），或者染细胞的时候buffer 用100ul 而我通常用50ul。我觉得也没什么
大的区别，抗体浓度以致就可以，也没有特别的重视。
结果昨天我在这边做第一个比较大的实验，我也轻车熟路地按照自己脑子里的步骤在操
作，结果旁边看的犹太女问我加了多少buffer，我也没有和她顶，心想你看到了那我就
再加50ul吧，结果犹太女马上就说“... 阅读全帖 |
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H********g
发帖数: 43926 | 5 刚才实验了一下，发现iphone因为镜头顶上还有个密封的玻璃/硬玉罩子，所以镜头离
表面有些距离。由于是广角镜头，光用1-2mm半径的水珠盖不住整个视野。所以水珠必
须有点大才行。
最后用50ul水挂在相机顶上的圆玻璃上，正好自然形成一个圆边，而且可以翻过来不到
处乱动，拍摄的微距效果还可以。下面是拍摄另一个手机屏幕的效果。被拍的手机也是
retina那个分辨率水平的，也就是说1个全色像素长度在0.1mm左右。（不过iphone这个
成像效果是比较扯淡的）
iphone的镜头附近是密封的，只有一个小孔可能是录音用的，放滴纯净水还是比较安全
的（大不了把那个录音孔贴上）。 |
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w*****t
发帖数: 49 | 6 说几句我的lab manager.他,男的,白人,比较憨厚,
干活比较bt,但是作pcr,酶切,clone从未见过返工.
1.primers设计就不说了----其实这一步是非常重要的.
2.pcr, 一般是20ul试试primer,然后上一排 8 X 50ul 体系. |
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y*********r
发帖数: 78 | 7 想用openbiosystems 的shRNAmir(lentivirus) 的高效价病毒转染T cell去knock down
一个基因， 可是只有50ul病毒.担心实验不工作， 把病毒浪费了。 哪位有经验的告
诉一个work 的protocol. 谢了。 |
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m**i
发帖数: 47 | 8 我老板让我用PCR做出10mg 600bp的DNA, 不许用养细菌的办法提质粒再切。我目前最多
能得到3ug/50ul PCR reaction, 离10mg也差太远了。各位有什么好办法吗？多谢多谢
了!!! |
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g*****y
发帖数: 6325 | 9 200ul体积实在太大了。 酶切总体积不应该超过50ul. 如果需要切很多，应该分几个
tube, 比如5个tube, 40ul/tube. 跑胶
后在合并起来。我觉得你放太多dna。 |
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h*****9
发帖数: 4028 | 10 太高了。通常都是1-2ug/50ul。另外你的酶量加太多Glycerol可能会对酶切不利。
回收只要是跑胶纯化，未梅切质粒污染应该非常少。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 11 do you have plate reader? I use fluorescent plate. you can make do with 50ul
yes you need a standard curve |
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l**********n
发帖数: 201 | 12 Promega TNT systems.
1ul in 50ul rxn can be detected by anti-Flag Ab.
use 10ul for co-ip as the starting point. |
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n***w
发帖数: 2405 | 13 1。您的意思是比如说50ul体系用0.2ul pfu, 加0.6ul taq？太多了吧。。。
2。pfu应该要hot start吗？
谢谢。。。 |
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p****z
发帖数: 31 | 14 我也就是这几次出现这种情况，也试过只吸下层，还是不行。比如说取100ul，吸到
50ul左右的时候，就会发现白色的不容物也开始一起被吸进去。这东西很奇怪，很容易
和样品混在一起。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 15 cDNA的量直接影响x轴截距，也就是Ct值。当然影响大了。引物只影响平台的高低，跟
Ct值没有直接关系。当然就是没啥影响了。
1ul，不要说试验人员的加样技术不行，就连枪都不一定过关。唉！厂家建议的50ul，
被鸡贼的PI改成25ul，后来不断改成15，甚至10。做人不能太贪心。 |
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l*****a
发帖数: 1431 | 16 tried 10ug in 50ul, didn't give complete cut.
but 10ug in 100ul worked very well |
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v*******n
发帖数: 8995 | 17 EMD 有一个sc1000, 120刀， 50ul，
mouse 里面， western，ihc，IF
通吃。在mouse embryonic stem cell 做western 很暴力。 |
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v*******n
发帖数: 8995 | 18 EMD 有一个sc1000, 120刀， 50ul，
mouse 里面， western，ihc，IF
通吃。在mouse embryonic stem cell 做western 很暴力。 |
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k*******s
发帖数: 214 | 19 gDNA酶切有几个注意事项
1. gDNA一定要干净，质量好。酶切之前要跑胶看看。
2. 酶切体积要大些，1ug的要50uL体积更好
3. 酶要多加些，一般要总体积的5%
4. 酶切反应时间可以延长到overnight. 一般在反应几个小时后，可以再加几ul酶继
续切。
5. 最后跑胶应该是很好的smear现象。
酶切gDNA一帮可用来做Southern blot.
200ng/ |
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b*******6
发帖数: 39 | 20 具体步骤基本是这样的：
1 PCR 50-100 ul体系，所得产物跑胶后回收，所有产物均酶切（大概5ug，可能很多，
但是太少了最后会看不到；Fastdigest推荐protocol是切200ng 1ul酶，10min；所以开
始的时候切3个小时，因为当初质粒3个小时能切下来；后来过夜切，出现2个条带；PCR
产物比比质粒难切）；质粒一般切4ug，3个小时（BamH1切1小时，Hind31小时，碱性磷
酸酶1小时），或者在Bamh1灭活之后Hind3过夜切（BamH1据说明书超过1小时就有星号
活性）；酶切体系50ul，Fastdigest酶各1ul。所有酶切产物切胶回收，nanodrop定量。
2 连接50ng质粒，50ng片段（大小比是5：1，所以数量比大概是1：5），10ul体系，室
温1小时或者4度过夜。
3 转化：5ul产物加入到50-100ul感受态，冰浴30min，42度热激90s，冰浴2min，加入
800ul LB，37度30-45min，3500rpm 3min 离心，留100-200ul混匀细菌涂板。 |
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i******k
发帖数: 4625 | 21 谢谢MM！
如果我的beads少于50uL，用这个column好操作么？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 50ul 勉强还可以，再小就不好操作了，
所以对于特别小的体积要加适量的blank sepharose beads. |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 beads 量太小（少于50uL) 可以加适当的blank sepharose beads来填充体积。
管太多的时候就像你说的那样，挺麻烦的，特别是装那么多column很烦，特别
耗时间。不过装完之后就好了，可以把所有column 都装在那种Qiagen rack 上，
一起洗，其实还蛮方便的。我最多的时候同时做过8管。
另外，你指出这个是对的：在大部分情况下的确是可以用IgG 来做loading control。
用这个矫正体积后再跑胶。
我们实验室经常是做crosslinked IgG, 没有办法用这个loading control，
所以我一下子还真没有想到这一点。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 24 How do you do transformation?
using ligation product or the sequenced plasmid?
if you use sequenced plasmid and the concentration is around 200 ng/ul, you
simply can do a quick transformation (1ul DNA + 50ul competent cells (or
even 20ul), 20 minute on ice, 45 seconds 42 degree heat shock, 2 minute on
ice, then plate all of them).
and always set up controls.
可是transformation以后plate上没有菌落。这种情况应该怎么处理呢，是放在室温（
25）或者更低（17）incubate 过夜？ |
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H*g
发帖数: 2333 | 25 I used only supernatant this time. I also saved precipitate and haven't
tested
yet. I only ran supernatant with SDS-PAGE since I sincerely hope I could
observe a huge band somewhere, however, I didn't.
I used Invitrogen SimpleBlue (same as CommassieBlue) and haven't tried WB.
I will run SDS-PAGE precipitate as well (such as to add 50uL loading buffer,
boil and load 20 uL onto each lane).
Thanks a lot and let's go SUNNY! |
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H*g
发帖数: 2333 | 26 Do you mean whole lysate by just adding loading buffer (let's say 50uL to
precipitated E.coli from 1mL culture), boiling for 5min, and loading 15uL to
each lane on SDS-PAGE? |
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f******p
发帖数: 178 | 27 稀释太多了，我每次只用50ul稀释
ug。
100ul |
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d******u
发帖数: 178 | 28 cDNA (from 2ug total RNA): 5ul
10X Pfx buffer: 12.5ul
10mM dNTP: 3ul
50mM MgSO4: 2ul
Fwd primer (10uM): 2ul
Rev primer (10uM): 2ul
Platinum Pfx: 1ul
dH2O: 22.5ul
_______________________________
50ul/rxn
+10X enhancer: 5ul
PCR:
94C, 5min
__________
94C, 15sec
60C, 30sec
68C, 3min
__________35X
68C, 7min
4C, for ever
我用PrimerExpress设计引物，标准60度Tm。 |
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s*********y
发帖数: 387 | 29 处理了大概30个质粒，还有30-50个需要大提，
处理的30个中，主要是pCDNA和peGFP的质粒，插入大概3k 到 8k的基因片段
部分比较好，150ml菌，能有1000ng per ul浓度，有1ml体积
部分比较的诡异，浓度只有30 ng per ul，在1ml的体积中。
但是测序的 时候 都是 对的！！！！而且浓度低的 mini prep没有任何的问题
浓度在200 ng per ul，体积在 50ul |
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s******r
发帖数: 2876 | 30 给你一个最便宜的，
0.05M NaOH, 50 ul, 煮10分钟，加50 ul 0.1M Tris/HCL pH6.8中和。
离心，取2ul PCR(50ul total reaction)。
用小鼠尾巴做genotyping，用的是有proteinase K的tail digest的protocol， 每只老
鼠要用20ul的20mg/ml的proteinase K， 很快就用完了。
请问大家有没有简单便宜的protocol可以推荐一下， 老板的ro1 没renew上呢.
谢谢了。 |
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l****i
发帖数: 20439 | 31 50ul total reaction太浪费了 20ul就足够.. |
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y*******a
发帖数: 303 | 32 我构建了一个kinase promoter 的plasmid DNA，backbone 是PSB系统， 我的质粒浓度
是0.1ug/ul， 每次转化加1ug左右到50ul的农杆菌里。电击转化已经做了十几遍了，很
难得到菌落，偶尔能找到几个，划线后再挑单菌落做colony PCR还是不对。不知道是什
么原因？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 对的，因为假如是100ul的上样环，注入200ul样品的话就会有100流到废液
里面去了。所以在你的情况下只好用1ml的环了。
有的人会采用先注射100ul，上得差不多之后停止走柱再来100ul，
但是这种方法很不好掌握，我强烈不建议。
最后，一般原则是注入体积尽可能要和环的大小接近，比方说如果你只有50ul
的话，如果用1ml的环，在注入过程中就会由于液面的扰动而被稀释。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 34 我现在用的protocol就是：
purified dna: 10ul (1ug)
dATP (10mM): 1ul
10x taq buffer: 5ul
MgCl2 (50mM): 1.5ul
Taq: 0.2
add dH2O up to 50ul
72 degree for 20min
我没理解你最后说的意思。
你是说用phusion做完纯化最后一步用稀释的Taq buffer洗？
谢谢。 |
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f****h
发帖数: 41 | 35 I have a question to ask people who know molecular biology. I have a plasmid
in DH5a cells and I can get 10ug DNA (200ng/uL, 50uL) from 1.5mL miniprep
culture. However, when I cultured 250mL for maxiprep, I only got 130ug DNA,
which is more than 10 times less than what I expected. The procedure of
extracting DNA should be fine because I got 900ug DNA from another plasmid
in parallel.
Can anyone give me some comments/suggestions? Thank you so much! |
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g*********5
发帖数: 2533 | 36 So, Which kit is suitable?
and can I concentrate the plasmid?
50ul to 6ul, then use them? |
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h***e
发帖数: 146 | 37 我也经常做
引物有80甚至100bp的尾巴
高GC可以加DMSO
我们都是用50ul体系 酶有Phusion或者5primer的taq很好pcr的
楼主莫非是要做recombineering？ |
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a*******a
发帖数: 4233 | 38 不需要洗， 收病毒上清以后pall 0.45um滤器过滤一下。
我一般用fugene hd， 更省事
10cm dish 20ug质粒，50ul fugene。
我是用plko+r8.91+vsvg的。
ps 我个人觉得钙转最省事
5min转完， 10-24小时之内看心情换液就可以了。。。。
脂质体的话还要等半个小时穿插传其他细胞，麻烦。。
，不洗的 |
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a********k
发帖数: 2273 | 39 0,determine a pcr condition works for all primers
1,set up 50ul reaction
2,stop at 20 cycle, get 5ul to run a gel
3,5 more cycles, 5ul run gel
4,repeat 3rd step for 3 times
5,run a gel after 40 cycles
6,pick a gel to satisfy your boss
traditional PCR. |
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x**2
发帖数: 255 | 41 你这个50ul的总体积放了10ul的10xbuffer? |
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t**m
发帖数: 158 | 42 天知道你的DNA用了多少量...
另外, 10ul 10xbuffer in 50ul? |
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s********r
发帖数: 312 | 43 我是biorad的那个loading buffer,950ul+50ul beta-ME,然后用水1:1稀释。直接加到
孔里，一般12孔板一个孔100-250ul，晃一晃等2分钟，然后200ul的tip前面剪掉，刮一
刮收起来，煮沸上样。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 44 自打来了美国，就再也不想自己配胶了。。。
Bio-Rad 50ul/well Gel用着很爽！
说保值期一年，可过期了还用着挺好！--据销售人员说，他们的胶其实是保值两年的。
但写着是保值一年。 |
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N2
发帖数: 81 | 45 primers:
Forward primer: the matched part should be 30-35mer, tm~65C,
Reverse primer: should be >30-35er, could be 40-55mer if you don't have a
tail, the long the better, matched base pairs have tm around 65.
cycles:
using phusion polymerase, add 5% DMSO(2.5ul/50ul), annealing temperature>=
68C.
For the long primer pcr, the main problem is the primer dimer and the second
structure of the primer. So you need a long matched length to give space to
increase the annealing temperature and break any p... 阅读全帖 |
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i*******n
发帖数: 48 | 46 如果cell signaling有的话,我们一般用CST的，时间也不是很长，一支抗体约2000RMB~。
第二选择是PTG，国内叫武汉三鹰，买了几十只，90%都不错，1:3000可用
他们有50uL包装，加税约1000RMB.
http://www.ptglab.com
proteingroup
在国内抗体得省着点用，钱是一方面，主要原因还是货期长。抗体用完之后回收－２０
冻起来，可以用很多次。
Good luck |
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k******0
发帖数: 1073 | 47 比如你用50uL高盐（3－500 mM）洗脱，用低盐稀释3－5倍就行了。
回收率还是很高的，95％以上吧。不过我的蛋白质浓度很高的。 |
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b******r
发帖数: 111 | 48 These days, almost make me desperate to death. As a 2-year post-doc,who did
lots of cloning, I fail to do such an easy work. Isolate mouse genomic DNA
by phenol/chloroform,75%ethanol precipitation. Then digest by HindIII
restriction enzyme as follows:
genomic DNA: 2 ug,1ug,and 0.4ug;
HindIII enzyme: 70 units(3.5ul,and different units);
Buffer: 5 ul
add water to 50ul
37 degree for 10 hours. Run gel.Genomic DNA is still a strong band, not
smear at all. I have try HindIII from NEB and Roche com... 阅读全帖 |
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s*****i
发帖数: 315 | 49 Eppendorf 有可以精确到50ul的，电子的，最大500ul
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8 |
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