c*****n
发帖数: 233 | 1 从提取rna开始，到RT-PCR一个5kb的基因。做了两个多月了，一直没成功。大家有什么
建议。是不是5kb太大了，不容易成功？ |
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c*****n
发帖数: 233 | 2 yes, I tried. I can detect several low bands around 1.5kb-0.5kb. But those
are not my target. |
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m*******3
发帖数: 113 | 3 听大家说离线下载速度快，在淘宝花9块钱买了个qq旋风L8账号（迅雷正常下载在我这
边貌似完全被封了，不知道离线怎么样），下了个岛国艾薇片，瞬间下到服务器上。
可是拖到本地的时候，速度不到5kb，有时候甚至B/S。。。。虽然我家网络不是很给力
（3M），但也不至于这么怂吧。。。
不知道大家有什么建议么，迅雷离线在美国这边好用么？ |
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z*y
发帖数: 84 | 4 需要做定量PCR，以RNA为模板，PCR产物在3-5Kb左右，能否推荐一个好的定量RT kit
和 PCR kit？谢谢！ |
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m*********n
发帖数: 158 | 7 vector 就5kb, insert 0.5kb
用pfu， pcr mutagenesis
dpni消化
然后transformation
挑clone后，我一搬习惯先跑交，发现总有很多clone size around 3kb
我vecotr 5kb也不大呀，这是为什么？
谢谢 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 8 我正好在做这个，8kb的plasmid，用Pfu貌似没问题，PCR出一堆smear，然后digestion
，transformation
但我接着这里也有俩问题：
1. 从板子上挑选不同的colony摇菌，提质粒，测序，发现有的成功引入突变，有的没
有引入突变，有的甚至出现其他地方（不应该出现的）什么deletion之类的。。
这如何解释呢
2. 8kb的target of interest大概是2.5kb；我现在是设计10对引物覆盖这2.5kb，等于
把整个2.5kb都测一下。。。需要这么做吗？因为虽然大家说Pfu很高保真，但我依然害
怕引入其他的乱七八糟的东西，毕竟PCR的产物是一堆smear。。。其实我都好奇这种
long-range PCR到底发生了什么。。。 |
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发帖数: 1 | 9 想成立一家技术服务+研发的公司，早期以技术服务为主，在有利润充分保障的情况下
，再考虑向 研发倾斜。
就我自己能力而言，我在质料克隆，基因表达细胞株的建立和某些方面的生物信息学方
面有所专长。
在基因的亚克隆方面（就是把一个基因从一个质粒载体转到客户指定的另一个质粒中）
，我有独门技巧，可以节省不少耗材和时间。亚克隆一个<1kb和5kb基因的质粒的平均
周期分别为3天和10天， 试剂耗材成本平均分别为$15和$80左右。 对于<2kb基因的质
粒亚克隆，以我的方法，一般只要挑选3个克隆即可以得到至少一个阳性质粒克隆，所
以我估计每三天我可以完成至少20个基因以上的亚克隆。我的问题是， 基因亚克隆这
方面市场大不大？
现在市面上的克隆服务多是基因的直接克隆，即用PCR方法将获取的基因插入到公司或
客户指定的质粒中。收费都在$250以上（对<1kb基因而言， 5kb基因大概要上千元）。
这方面我并没有特别的技巧，和那些公司比没有竞争优势。而且基因碱基的多态性太
普遍，PCR克隆到的基因蛋白编码序列不一定会是客户所想要的。暂时无意开展这种类
型的克隆服务。
在基因表达细胞株的筛选与建立方面，... 阅读全帖 |
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h***9
发帖数: 662 | 10 一个准备用来做knock-in老鼠的targeting vector（14kb),用invitrogen的kit做了
maxi-prep,然后用NotI linearize,我确定NotI是单一酶切位点,可是为什么出来这么多
大大小小的片断（4kb,2.5kb,1.5kb,100bp)？ |
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s******a
发帖数: 472 | 11 谢谢。
突然意识到我可能做不了long range PCR。我正在做的两个targeting vector A和B，A
的long arm和short arm分别是7kb和5kb；B则是6kb和3kb。3-5kb的基因组PCR应该很难
P吧？
PS，是不是没有必要整这么长的homologous arm？天真的想法是越长越好。。。
homology |
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n********k
发帖数: 2818 | 12 First of all, I could be wrong but I am not sure you are on the right track
trouble-shooting so far...
As some said, this RNA extraction is not that good...That said, for a
cloning work, this may not be a problem at all...different goals require
different quality...As for protein or organic solvent etc, it may not be
that good but it is presumably fine, not horrible I would say..with today's
enzymes(very powerful), it is likely not a problem either...it would be very
bad if you were try to deter... 阅读全帖 |
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c******r
发帖数: 3778 | 13 what's your purpose to RT-PCR 5kb?
if just to clone it, best to buy and clone from a plamid.
if to detect expression, best to do RT-PCR with smaller fragment.
if to look for mutations, best look in specific range.
if to check integrity, best to probe for northern.
...
Direct RT-PCR a 5kb fregment might not be an easy job for a beginner. You
might spend several months, even a year and end up nothing. Try to work
around the problem might be a better choice. |
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x******o
发帖数: 76 | 14 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。 |
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S*********e
发帖数: 127 | 15 I am dealing with a gene with incomplete 5' CDS. 5.5kb 3' CDS already known.
Need to RACE 5' end (~5kb left). Does anyone have a good kit to recommend
for long cDNA synthesis and 5'RACE? many thanks, |
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j****x
发帖数: 1704 | 16 你说的没错，这类载体的插入片段大小非常受限，一旦超过2.5kb就很难包装了，如果
把WPRE等其他非必需element删除的话，大致包装极限能到3.5kb的样子。
能合成复杂重复序列的公司还是有的，稍微贵点儿而已。 |
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发帖数: 1 | 17 想成立一家技术服务+研发的公司，早期以技术服务为主，在有利润充分保障的情况下
，再考虑向 研发倾斜。
就我自己能力而言，我在质料克隆，基因表达细胞株的建立和某些方面的生物信息学方
面有所专长。
在基因的亚克隆方面（就是把一个基因从一个质粒载体转到客户指定的另一个质粒中）
，我有独门技巧，可以节省不少耗材和时间。亚克隆一个<1kb和5kb基因的质粒的平均
周期分别为3天和10天， 试剂耗材成本平均分别为$15和$80左右。 对于<2kb基因的质
粒亚克隆，以我的方法，一般只要挑选3个克隆即可以得到至少一个阳性质粒克隆，所
以我估计每三天我可以完成至少20个基因以上的亚克隆。我的问题是， 基因亚克隆这
方面市场大不大？
现在市面上的克隆服务多是基因的直接克隆，即用PCR方法将获取的基因插入到公司或
客户指定的质粒中。收费都在$250以上（对<1kb基因而言， 5kb基因大概要上千元）。
这方面我并没有特别的技巧，和那些公司比没有竞争优势。而且基因碱基的多态性太
普遍，PCR克隆到的基因蛋白编码序列不一定会是客户所想要的。暂时无意开展这种类
型的克隆服务。
在基因表达细胞株的筛选与建立方面，... 阅读全帖 |
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U***g
发帖数: 330 | 18 163还是169拨号，5KB不到的速度，电话一拿起来就断了 |
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y****g
发帖数: 36950 | 19 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: yugong (愚公挖坑), 信区: Joke
标 题: 贵州巨锅天眼终于收到外太空文明信号，霍金警告“不要回答”然而为时已晚！
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Oct 7 22:07:48 2017, 美东)
贵州巨锅天眼终于收到外太空文明信号，霍金警告“不要回答”然而为时已晚！
2017-10-07 老兵社区
2017年9月28日，中国贵州射电望远镜“天眼”接收到一个来自外太空4光年外的可疑信
号。
随后，霍金郑重向中国警告：“不要回答！不要回答！不要回答！”
后经过中国政府对外星文明接触各种可能性的慎重考虑和分析，决定不能放过这次千载
难逢的机会，并认为中国不回答其他国家也会回答，而且指出这次的交流也许可以引发
全人类科技的大跃进。
中国决定回答。
之后中国科学家宣布了发现了太阳的分层结构，可以利用太阳当作一个电波放大器，将
人类的信号扩大发送到宇宙中。
随即，霍金最后一次警告：“不要回答！不要回答！不要回答！”
中国用太阳向接收4光年外信号的方向，回复了一封信息。内容包括地球行星概况、地
球生命系统概括、世界历史基... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 20 只有这S-蛋白的前1.5kb极其不同，其他部位都与蝙蝠蛋白极其相同。两个极其，你就
想吧。自然
界都是even out |
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o*****g
发帖数: 3936 | 21 上面写data Pay per use 1￠/5KB，不知道家里上wifi算是data吗？谢谢！ |
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r******e
发帖数: 396 | 22 真boring呀
想shopping却没有米，
想travle也没有米，
只能在家下韩剧，
速度只有5kb/s
周末有版聚么？。。。 |
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c*******a
发帖数: 1879 | 23 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: yugong (愚公挖坑), 信区: Joke
标 题: 贵州巨锅天眼终于收到外太空文明信号，霍金警告“不要回答”然而为时已晚！
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Oct 7 22:07:48 2017, 美东)
贵州巨锅天眼终于收到外太空文明信号，霍金警告“不要回答”然而为时已晚！
2017-10-07 老兵社区
2017年9月28日，中国贵州射电望远镜“天眼”接收到一个来自外太空4光年外的可疑信
号。
随后，霍金郑重向中国警告：“不要回答！不要回答！不要回答！”
后经过中国政府对外星文明接触各种可能性的慎重考虑和分析，决定不能放过这次千载
难逢的机会，并认为中国不回答其他国家也会回答，而且指出这次的交流也许可以引发
全人类科技的大跃进。
中国决定回答。
之后中国科学家宣布了发现了太阳的分层结构，可以利用太阳当作一个电波放大器，将
人类的信号扩大发送到宇宙中。
随即，霍金最后一次警告：“不要回答！不要回答！不要回答！”
中国用太阳向接收4光年外信号的方向，回复了一封信息。内容包括地球行星概况、地
球生命系统概括、世界历史基... 阅读全帖 |
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s*****e
发帖数: 21415 | 24 $25 for 500MB在哪儿啊？
怎么我查的需要 1c for 5kb，算下来$25才12.5M |
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y****g
发帖数: 36950 | 25 贵州巨锅天眼终于收到外太空文明信号，霍金警告“不要回答”然而为时已晚！
2017-10-07 老兵社区
2017年9月28日，中国贵州射电望远镜“天眼”接收到一个来自外太空4光年外的可疑信
号。
随后，霍金郑重向中国警告：“不要回答！不要回答！不要回答！”
后经过中国政府对外星文明接触各种可能性的慎重考虑和分析，决定不能放过这次千载
难逢的机会，并认为中国不回答其他国家也会回答，而且指出这次的交流也许可以引发
全人类科技的大跃进。
中国决定回答。
之后中国科学家宣布了发现了太阳的分层结构，可以利用太阳当作一个电波放大器，将
人类的信号扩大发送到宇宙中。
随即，霍金最后一次警告：“不要回答！不要回答！不要回答！”
中国用太阳向接收4光年外信号的方向，回复了一封信息。内容包括地球行星概况、地
球生命系统概括、世界历史基本信息、全部信息为17.5KB。
历史学家命名这一天为“回复日”。
几天后，全球射电基地同时收到了数以万计的宇宙信号，全部来自四光年外的同一个方
向。面对如此反常的信号，人类终于意识到了危险和恐惧。
联合国紧急召开会议，共同研究外星信息内容破译，并宣布全球进入战备状态。
在这... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 26 【 以下文字转载自 SanFrancisco 讨论区 】
发信人: centralla (central LA), 信区: SanFrancisco
标 题: 贵州巨锅天眼终于收到外太空文明信号，霍金警告“不要回答”然(转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Oct 7 22:52:34 2017, 美东)
发信人: yugong (愚公挖坑), 信区: Joke
标 题: 贵州巨锅天眼终于收到外太空文明信号，霍金警告“不要回答”然而为时已晚！
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Oct 7 22:07:48 2017, 美东)
贵州巨锅天眼终于收到外太空文明信号，霍金警告“不要回答”然而为时已晚！
2017-10-07 老兵社区
2017年9月28日，中国贵州射电望远镜“天眼”接收到一个来自外太空4光年外的可疑信
号。
随后，霍金郑重向中国警告：“不要回答！不要回答！不要回答！”
后经过中国政府对外星文明接触各种可能性的慎重考虑和分析，决定不能放过这次千载
难逢的机会，并认为中国不回答其他国家也会回答，而且指出这次的交流也许可以引发
全人类科技的大跃进。
中国决定... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 19049 | 27 13. 红红红红岸之三
红岸工程部分文件，这批文件的解密时间是叶文洁向汪淼讲述红岸内幕三年之后。
一、世界基础科学研究趋势中一个被忽略的重要问题（原载《内部参考》196口年口月
口日）
【提要】从近代史和现代史上看，科学基础理论研究成果转化为实用技术有两种模式：
渐进型和
突变型。
渐进型：基础理论成果被逐步转化为应用技术，技术逐渐积累，最后产生突破。最近的
例子有宇
航技术的发展和突破。
突变型：基础理论成果被迅速转化为实用技术。产生技术突变。最近的例子是核武器的
出现，直
到四十年代，还有一部分最优秀的物理学家认为释放原子能是永远不可能的事。但核武
器在极短
的时间内突然出现，基础科学向应用技术的转化跨度极大，时间极短，我们定义为技术
突变。
目前，北约和华约集团基础研究空前活跃，投入巨大。所以一项或多项技术突变随时都
可能发生
，这将对我战略规划构成重大威胁。
文章认为，我们目前的目光主要集中在技术的渐进型发展上，而对可能发生的技术突变
没有给予
足够的重视。应当从战略高度，制定一套完整策略和原则，当技术突变发生时能够正确
地应对。
文章列出最有可能发生技... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 19049 | 28 ☆─────────────────────────────────────☆
casact (尝尝也) 于 (Fri Jul 22 20:55:29 2011, 美东) 提到:
刘慈欣
《三体》终于能与科幻朋友们见面了，用连载的方式事先谁都没有想到，也是无奈之举
。之前就
题材问题与编辑们仔细商讨过，感觉没有什么问题，但没想到今年是文革三十周年这事
儿，单行
本一时出不了，也只能这样了。
其实这本书不是文革题材的，文革内容在其中只占不到十分之一，但却是一个漂荡在故
事中挥之
不去的精神幽灵。
本书虽不是《球状闪电》的续集，但可以看做那个故事所发生的世界在其后的延续，那
个物理学
家在故事中出现但已不重要，其他的人则永远消失了，林云真的死了，虽然我有时在想
，如果她
活下来，最后是不是这个主人公的样子？
这是一个暂名为《地球往事》的系列的第一部，可以看做一个更长的故事的开始。
这是一个关于背叛的故事，也是一个生存与死亡的故事，有时候，比起生存还是死亡来
，忠诚与
背叛可能更是一个问题。
疯狂与偏执，最终将在人类文明的内部异化出怎样的力量？冷酷的星空将... 阅读全帖 |
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wh
发帖数: 141625 | 29 当然是下个月。几千万的谁看啊……超过5kb的不看…… |
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B*********L
发帖数: 700 | 30 我用S2,我太太用4S. 如果你S2搞不定，iphone一样搞不定.
当初IT可能把你的手机设错了，改一改不用专人输公司密码.
Setting=》account and sync=>选你的exchange account=>account setting=>
1.period to sync calendar 选2week
2.size to retrieve emails 选5kb
多半就好了。 |
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d*******y
发帖数: 65 | 31 我再找IT问问, 好象是公司信息保密的原因,我以前想自己装公司邮箱装不上,还跟手机
公司客服讨论了半天, 最后说是要我们公司的IT输个什么才行. IT 也跟我说装公司邮
箱必须找他们.
我的account setting里目前是1 week 和20kb. 改成5kb了, 保留1 week. 不知会不会
好些. 多谢! |
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l*****r
发帖数: 15615 | 32 那个估计还是不行，edge speed test连5KB都不到。 |
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p*********e
发帖数: 32207 | 33 edge在信号好的地方大概有200-300Kbps的，算下来也有三四十KBps了
5KB不到的话恐怕是coverage的问题，或者运营商加了限制。 |
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t******8
发帖数: 2803 | 34 我系统分区在Western Digital黑盘上，当时双系统，在XP下用partition magic分的区
，装好以
后用过几次Ghost来重装系统，没考虑什么alignment。今天下了个HD Tune看了一下，
结果见图。
请大侠看看这两个分区（Win7 C盘和Win XP D盘），Alignment一项分别显示0.5KB和
1KB。请问
这样正确不正确？要不要手动调整Alignment？
还有新的那个Samsung F4，插上去以后是不是需要Full Format才能让系统识别它是4k
sector体
系，而不是512 byte体系？ |
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s******n
发帖数: 6806 | 36 离线下载到底是什么原理? 看的话还是得下载或stream到本机吧，那不是一样吗 |
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e*******n
发帖数: 2178 | 37 谢谢。我查了一下protocol，说是up to 8kb。我的情况是插入片段是8.7kb，质粒是3.
5kb左右吧。不知道行不行？
Kit |
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h********n
发帖数: 4079 | 38 lentivirus construct 上两个LTR之间的长度是不是有上限? 好像是8K?
我手头这个construct一共13.3Kb, 其中5'LTR -- sin LTR有7.5Kb, 有没有可能插入一
个2K的promoter+gene?
做lentivirus的高人请指教一下,
谢谢 |
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v***a
发帖数: 1242 | 39 拿有我insert DNA的plasmid去测序，用的是在vector上的primer（在insert的两边）
来读序列（是测序公司提供的T7和T3 primer），结果insert的头和尾总是有大概15～
20个bp读不出，都是N（我的insert有1.5kb左右），不知道这个问题该怎么解决好？
还有一个问题，发现这个plasmid在insert DNA的大约970bp处有一个碱基突变，由A/T
突变为G/C，就这一个不符，不知道这个是因为什么原因呢？
谢谢高手们回答吖 |
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x********u
发帖数: 430 | 40 愿闻其详
我最近刚做好一个4.6kb, 另一个1.5kb,也打算将他们连接起来。
to |
|
n***w
发帖数: 2405 | 41 最近做克隆，2.4kb的片段已经出来了，现在要做的就是加酶切位点，然后插到vector
里去。但是跑了几次胶，结果不算理想，想进一步optimize，不太清楚怎么做。。。
见图。。。
两个引物的Tm分别是63.8和63.3。
我第一次PCR的条件是94度3min, 94度30s, 65度45s, 72度60s,72度5min，35个循环。
结果见图1。隐约可以在2.5kb左右见到带，但是很faint。曝光2s。
我第二次PCR的条件是94度3min，94度30s, 66度30s, 72度30s，72度5min，仍然是35个
循环。结果见图2，比第一个是要好多了。貌似有些拖尾。。。
我第三次PCR的条件是94度4min, 94度30s, 66度40s，72度40，72度5min, 35个循环。
结果见图3。目的带是强了不少，但是有些弥散，还有些杂带。
我觉得还需要进一步去优化条件。
请大家给我出出主意。。。
谢谢。。
ps，第二次和第三次的引物比第一次多加了0.1ul。。。模版的浓度大概30ng/ul，上了
1ul。
谢谢。 |
|
s******r
发帖数: 2876 | 42 试试hot start, 加touchdown，有时候有奇效。
最近做克隆，2.4kb的片段已经出来了，现在要做的就是加酶切位点，然后插到vector
里去。但是跑了几次胶，结果不算理想，想进一步optimize，不太清楚怎么做。。。
见图。。。
两个引物的Tm分别是63.8和63.3。
我第一次PCR的条件是94度3min, 94度30s, 65度45s, 72度60s,72度5min，35个循环。
结果见图1。隐约可以在2.5kb左右见到带，但是很faint。曝光2s。
我第二次PCR的条件是94度3min，94度30s, 66度30s, 72度30s，72度5min，仍然是35个
循环。结果见图2，比第一个是要好多了。貌似有些拖尾。。。
我第三次PCR的条件是94度4min, 94度30s, 66度40s，72度40，72度5min, 35个循环。
结果见图3。目的带是强了不少，但是有些弥散，还有些杂带。
我觉得还需要进一步去优化条件。
请大家给我出出主意。。。
谢谢。。
ps，第二次和第三次的引物比第一次多加了0.1ul。。。模版的浓度大概30ng/ul，上了
1ul。
谢谢 |
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r**a
发帖数: 121 | 43 我们从别的实验室得到一个果蝇的mutant（通过imprecise excision of P element)
缺失了一个片断，包括一个整个基因和它下游基因的部分
然后，我们要确定它的具体序列
我们在这个缺失片断的上游和下游都分别设计了引物对
确定了大概的缺失部分
然后，设计了几对横跨这个片断的引物
但是，就是怎么也拉不下来这个片断（片断理论上在1kb-5kb之间）
各位有什么经验或者建议
是不是有可能是有什么特殊的结构在这个之间，阻止了扩增？
还是有别的原因？
怎么改进PCR条件来得到这个片断呢？
谢谢了！ |
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x**x
发帖数: 92 | 44 Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
Vector: 5kb
Insert: 4kb
total: 9kb
用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
请大家给些建议， 谢谢。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 45 同事之前收到别人给寄过来的质粒，已经是大提好了的。送测序公司简单测了一个反应
，匹配。
后来同事基于这个质粒又构建了其他几个衍生，测序据说也都啥没问题。后来再做酶切
时，顺便点了个质粒对照，结果问题来了。
单酶切，双酶切，片段大小都正确。单单这个未酶切的质粒对照，不是正常超螺旋质粒
应有的迁移速率快于线形片段的情形，反而显示条带还显著大于单酶切后的线形片段。
（质粒大小6.5kb，正常的超螺旋结构约3.5-4kb,而该未切质粒显示8kb）
同事今天找我讨论，想了半天没法解释。从来没遇到这种情况，确切地说很少做质粒对
照，单双酶切正确就完了。没想到还有这种情况，怎么解释？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 5 kb不长
随便扩扩基本上都能出来啦
当然模板特别难扩那是例外
Takara的LA-Taq是好，不过拿来扩5kb的实在有点大材小用
我用它扩>10kb的 |
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