a*******u
发帖数: 2 | 1 请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？（该基因分子量接近300kd）
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人的细胞系或小鼠组织的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师
觉得一次扩增这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其
中片段都不成功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
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S******e
发帖数: 393 | 2 我是这样做的：从公司买的cDNA（这样可以保证质量），好像也不贵，
然后用pfu（pfu from invitrogen or NEB，记不清了，两家都用过），
扩了两个4kb,测序，然后拼接为8kb的片段。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 3 自己拼啊。
关键看你想干嘛。
如果想克隆出来慢慢玩儿，8kb，两段要是不行，分3段，4段怎么都可以了啊。不要用
random primer，用自己design几个primers也没多麻烦。顺利的话两个礼拜，不顺利一
两个月怎么也可以了。
如果需要很多samples拿来测序，一次扩也可以，但是要摸条件，RT需要调整protocol
，否则拿不到那么长的cDNA。慢慢试啦，不一定100%都可以成功，但是也不是不可能啦
。 |
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发帖数: 1 | 4 我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
：1：0.5。
等有了8kb这个克隆，你就可以直接PCR中间3kb-1kb-2kb，然后... 阅读全帖 |
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w***g
发帖数: 5958 | 6 怎么搞就只能搞到30MB/s的速度。7200RPM的硬盘，裸写应该可以达到100MB/s。用stra
ce发现底层是用writev实现的，每次只写8KB多一点。即使用了rdbuf()->pubsetbuf也不
行。改成FILE和fwrite后，默认也是每次写8KB多一点(BUFSIZ=8KB)，但是setvbuf后就
可以buffer任意大了。这次本牛也搞不定了，希望版上的大牛们给支援一下。 |
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b********9
发帖数: 1061 | 7 最近一直在做cloning,一个3Kb, 一个2Kb，一个8Kb，连在一起，酶切为点：pstI,
HindIII, and NotI 怎么连也连不上，已经做了2个月了，哪位大虾帮帮忙？
3Kb: pstI and Not1
2Kb: notI and HindIII
8Kb: PstI and Hind III.
多谢。 |
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a*******u
发帖数: 2 | 8 请问PCR扩增8kb的一个基因是什么难度？
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人或小鼠的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师觉得一次扩增
这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其中片段都不成
功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 rt
有没有人用QuikChange Mutagenesis PCR protocol做过8 kb plasmid？
以前小质粒，4、5 kb的都没什么问题，换碱基、插入、去除什么都行
这次一个8kb的，一共只要替换6个碱基，怎么做都出不来条带
试过优化条件，不同模板浓度，不同PCR条件，加reagent去除2级结构什么的
是不是8kb太长了？ |
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X******n
发帖数: 914 | 10 6个一起没问题。我也经常用Sp抗性的质粒转top 10，没问题.
8kb一下的pcr突变或deletion,107左右的转化效率足够了，如果是8kb以上的，我通常
都用108-109以上转化效率的细胞。 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 11 我正好在做这个，8kb的plasmid，用Pfu貌似没问题，PCR出一堆smear，然后digestion
，transformation
但我接着这里也有俩问题：
1. 从板子上挑选不同的colony摇菌，提质粒，测序，发现有的成功引入突变，有的没
有引入突变，有的甚至出现其他地方（不应该出现的）什么deletion之类的。。
这如何解释呢
2. 8kb的target of interest大概是2.5kb；我现在是设计10对引物覆盖这2.5kb，等于
把整个2.5kb都测一下。。。需要这么做吗？因为虽然大家说Pfu很高保真，但我依然害
怕引入其他的乱七八糟的东西，毕竟PCR的产物是一堆smear。。。其实我都好奇这种
long-range PCR到底发生了什么。。。 |
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m*******e
发帖数: 21667 | 12 http://kamonka.blogspot.com/2007/11/blog-post_8605.html
汲取了越南战争的教训，里根总统把输出民主主义的大任，由中央情报局转交给了美国
民间，此后这个民主运动的民营化在欧亚大陆结下丰硕成果，如今甚至似乎已俨然茁壮
成长为一大产业。
本片原名[美国征服东方]，法国CAPA制作，在好意地介绍各国民主运动的同时，正如充
满法国媒体情调的片名一样，重点揭露了闪烁在颜色革命绚丽舞台背后的魑魅魍魎，从
美国两党政治团体的大显身手，到老当益壮的退役军人的暗中活跃等等。
由于国内媒体对这方面的报道周详入微，或许我们不会有日本观众那种拍案惊奇的感觉
，不过吉尔吉斯外交部长因为民主派报社印刷厂停电，而在美国议员面前低声下气接受
训斥的场面，仍不由令人张口结舌。
虽然本片的制作者显然没有注意到当时吉尔吉斯电力（Kyrgyz Energo）已经民营化这个
事实，白白丢失了加强抨击火力的良机，但这个场面仍然让我们深思，极力标榜[主权]
一词的普金政权的NASHI（俄语意思我们的）运动，或许比美国人的[善意的帝国主义]更
为健全和自然？
电驴下载：
[NHK]... 阅读全帖 |
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h***l
发帖数: 3048 | 13 这才是刘案的关键。老将们使尽了浑身解数，
想避开这点。NED做的事如下：
youtube 颜色革命的背后：
http://www.youtube.com/watch?v=1nLgxTZCylg
http://kamonka.blogspot.com/2007/11/blog-post_8605.html
汲取了越南战争的教训，里根总统把输出民主主义的大任，由中央情报局转交给了美国
民间，此后这个民主运动的民营化在欧亚大陆结下丰硕成果，如今甚至似乎已俨然茁壮
成长为一大产业。
本片原名[美国征服东方]，法国CAPA制作，在好意地介绍各国民主运动的同时，正如充
满法国媒体情调的片名一样，重点揭露了闪烁在颜色革命绚丽舞台背后的魑魅魍魎，从
美国两党政治团体的大显身手，到老当益壮的退役军人的暗中活跃等等。
由于国内媒体对这方面的报道周详入微，或许我们不会有日本观众那种拍案惊奇的感觉
，不过吉尔吉斯外交部长因为民主派报社印刷厂停电，而在美国议员面前低声下气接受
训斥的场面，仍不由令人张口结舌。
虽然本片的制作者显然没有注意到当时吉尔吉斯电力（Kyrgyz Energo）已经民营化这个
事实，白白... 阅读全帖 |
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h***l
发帖数: 3048 | 14 原因在这里，youtube 颜色革命的背后：
http://www.youtube.com/watch?v=1nLgxTZCylg
刘小波拿钱的NED是外国的特务机关
http://kamonka.blogspot.com/2007/11/blog-post_8605.html
汲取了越南战争的教训，里根总统把输出民主主义的大任，由中央情报局转交给了美国
民间，此后这个民主运动的民营化在欧亚大陆结下丰硕成果，如今甚至似乎已俨然茁壮
成长为一大产业。
本片原名[美国征服东方]，法国CAPA制作，在好意地介绍各国民主运动的同时，正如充
满法国媒体情调的片名一样，重点揭露了闪烁在颜色革命绚丽舞台背后的魑魅魍魎，从
美国两党政治团体的大显身手，到老当益壮的退役军人的暗中活跃等等。
由于国内媒体对这方面的报道周详入微，或许我们不会有日本观众那种拍案惊奇的感觉
，不过吉尔吉斯外交部长因为民主派报社印刷厂停电，而在美国议员面前低声下气接受
训斥的场面，仍不由令人张口结舌。
虽然本片的制作者显然没有注意到当时吉尔吉斯电力（Kyrgyz Energo）已经民营化这个
事实，白白丢失了加强抨击火力的良机，... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 5309 | 15 你喜欢天涯，劳资给你随便找了个天涯的帖子。贴主说中国电信搞鬼劳资无法确定，但
他实测网速只有8k-12k/s，这他妈的也叫宽带? 劳资90年代用的电话拨号都比这个快。
==
电信客服告诉我，2G的网速流量是170-210KB/秒才是正常的。我进去后一测试，我的网
速，下载一个518MB的文件显示要用12个小时，因为我的网速是8KB-12KB/秒，大家看看
是不是一个天大的笑话？！跟本就达不到正常流速的1/20.，然后，我又关掉防火墙和
杀毒软件，依然不行。
http://bbs.tianya.cn/post-free-1620328-1.shtml |
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发帖数: 1 | 16 这个牛大发了。。。。
1，开源自主研发的轻量级物联网实时操作系统TencentOS tiny。
2, 支持一键上云，对接云端海量资源。
3, 结合腾讯云物联网开发平台IoT Explorer，加上之前已经建设完成的国内最大规模
LoRa网络，
彻底打通从芯片通讯开发、网络支撑服务，物理设备定义管理，数据分析和多场景
应用开发等一站式、全链条IoT云开发服务能力。
4, 体积最小仅1.8KB、功耗最低2微安
5, 任务管理、实时调度、时间管理、中断管理、内存管理、异常处理等功能，
TencentOS tiny都支持
6, 支持意法半导体、恩智浦、华大半导体、瑞兴恒方、国民技术等主流厂商多种芯片
和模组 |
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发帖数: 1 | 17 仅1.8KB.
尼玛，就是个DOS也比这要大。 |
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i***0
发帖数: 8469 | 18 You have a test application that is issuing asynchronous un-buffered
sequential writes to a 15k RPM disk. The test application is able to get 150
IOPS for an IO size of 8KB. What is the throughput for the writes being
issued by this test application?
In 30 words, please describe the boot process of a Windows-based PC. |
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x******u
发帖数: 62 | 19 我前几天填了160表，然后存在了u盘上面，今天再上载就说我遇到了一个申请错误，请
稍后再试。怎么回事呢？有没有人遇到过这种情况啊？我的存下来的文件是个DAT文件
，只有8KB。不知道是不是当时没有存下来？？如果这样的话重新新填一个不知道可不
可以啊？ |
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s*******w
发帖数: 2257 | 20 看看奥巴马最新体检结果上都有什么？
标签： 时事 美国文化 美国法律
2016-03-14 01:49 阅读(5204)评论(0)
心路独舞
2016年3月8日，美国总统奥巴马的御医Ronny L. Jackson先生，向总统助理兼白宫新闻
秘书Josh Earnest发布了总统最新体检结果的备忘录，全文共有两页，已经上载到白宫
网站，供美国乃至世界有兴趣的人们前去了解（点击可进入），此前白宫曾四度公布过
总统的体检报告。
奥巴马总统的体检是在今年2月进行的，经过总统同意后公布的体检报告主要包括以下
三个部分：
1、基本健康数据（Vital Statistics）
这部分包括年龄（54.5岁）、身高（73.5英寸，相当1.87米）、体重（175磅，相当约
159斤）、BMI指数（22.8kb/m2）、静止心率（56bmp）、血压（110/68mmHg）、脉搏血
氧定量测量和体温等结果。
2、系统体检（Physical Examination by System）
这一部分包括眼睛、脖子、肺、心脏、消化系统、泌尿、肌骨骼、神经、皮肤的检查，
奥巴马总统交了一份满分的答卷。
3、... 阅读全帖 |
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b**********y
发帖数: 232 | 21 我估计那个阿三是想说buffer cache是block device layer的东西，page cache是VFS
层面或者OS层面的东西。
buffer cache不是4KB的 buffer，根据系统支持的block size不同，有512， 4K， 8KB
都有可能。不过这个概念好像在Linux 2.2之后就没有了。
不知道现在linux的block device layer还是否有cache。
这个问题很有深度，要么这个职位真的是与这个东西有关，要么就是那个阿三故意提高
门槛，找理由据你
不过，那个阿三能问这种问题，估计也是比较senior的人。 |
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c******r
发帖数: 512 | 22 I downloaded a short free 8kb/s one, it sounds awful and has an echo in the
background... just bearable quality as the website has honestly claimed. It's
hard to enjoy the book with this sound quality, guess I'll have to need the $3
ones at least.
of |
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u*****t
发帖数: 292 | 23
image
image
That's possible.
THe plasmid without digestion will generally have 3 bands based on the plasmid
configureation: the fastest one is supercoiled, the medium is linear ( both
strands of the plamsid were broken during extraction, and the slowest one is
the circular(one strand was broken). The quality determines the band pattern
in UNCUT plasmid.
You said only one band shows in 3-enzyme digestion. What is the size? You may
got four 2kb bands from a 8kb plasmid. BUT the most possible caus |
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D*******a
发帖数: 3688 | 24 一般语音不超过64kbit/s (8KB/s)
250mb是500多minute
但是voip接电话是个问题 |
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l**n
发帖数: 7272 | 26 256Gb的flash。
H2DQEG8VD1MYR
2xnm class
256Gb
2MB(8KB Page)
4
3.3v/X8
VLGA
Now |
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l***h
发帖数: 9308 | 27 我前面的帖子里面有个范例，我基本上是在那个基础上修改的。
比如范例里面，outbound 最大是800kbit/s，对应的p2p应用只给了1%，也就是8kbit/s
。对我来说就不合适，我的测试，如果要保证能流畅观看pplive，基本上，通过把上行
带宽控制在30kbit/s(4KB/s)就行了。但是，看CNTV，尽管对下行带宽要求不高（1M足
以），但对上行带宽要求比较高，至少要到60kbit/s(8KB/s)。所以，我的outbound 最
大设置为400kbit/s （DSL标称640kbit/s），对应P2P应用带宽最大限制为15%，也就是
60kbit/s。
如果你有电驴/bt下载应用的话，估计还要稍微修改一下。 |
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I**********s
发帖数: 441 | 28 来自主题: Programming版 - HTML5 因为现在计算机下一步的计算是在服务器端进行的, 所以它在连接网络. 不过这个传输
内容非常少: 每次运算需要的数据是棋的布局, 谁走下一步(), 难度等级是什么. 总共
大约40个字符.回传不超过10个字符. 如果一盘棋走20步, 计算机走一半, 只有大约50*
10=500个字符. 如果一个字符2字节, 只有1K数据传输量.
现在所有文件, html, javascript, 图象和声音, 加起来一共700KB. 另外我不知道具
体的浏览器会不会把声音文件保存起来使用. 如果不的话, 走棋的声音文件有8KB, 吃
子的声音文件有20KB. 如果走20步, 吃掉10个子, 一共是8*20+20*10 = 360KB. 700+
360就有1.06MB啦.
另外百度的记录访问的javascript可能会有一些别的流量. |
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d*****r
发帖数: 2583 | 29 ☆─────────────────────────────────────☆
Genemo (猜猜) 于 (Tue Feb 17 12:37:29 2009) 提到:
整个目标是把2个3.4kb的片段连在一个8kb的载体上
现在第一个已经连上去 是双酶切的
第二个怎么也连不上去了
这个是单酶切 为了避免过多污染 我直接PCR产物酶切 酶切位点旁边留了4个碱基给酶
bind
虽然PCR的模板是质粒 但我做了割胶回收
现在insert自连很多 和正常的连接差不多 很奇怪为什么自连了还能有抗性呢
这个问题不知道有么有高人见过而且解决过？
还有就是现在这个载体太大了 怎么才能提高连接效率呢
☆─────────────────────────────────────☆
albertsmwk (Stay in Bio) 于 (Tue Feb 17 12:52:48 2009) 提到:
载体用SAP处理，过夜酶切，过夜SAP，基本可以做到没有自连
insert自连。。。。你为啥知道啊？！难不成跑胶测序？
不行用takara的long ligase kit，做10K肯定没问题 |
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y******y
发帖数: 107 | 30 目的基因4.8kb, plasmid A 4.7kb。 ligation是用的pGEM－T easy vector的用来测序
的ligation方法，具体是
目的基因 150ng
plasmid A 50ng
T4 DNA ligase 1ul
2xbuffer 5ul
Total volume 10ul,
4C for 16h, 取2ul transformation。 |
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e*******n
发帖数: 2178 | 31 谢谢。我查了一下protocol，说是up to 8kb。我的情况是插入片段是8.7kb，质粒是3.
5kb左右吧。不知道行不行？
Kit |
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r*****m
发帖数: 231 | 32 把需要的位点设计在PCR引物的两端，PCR后用酶切然后连上vector。你的Lenti vector
应该至少有7，8kb吧，连个4kb的一般不会出问题。一般人做PCR cloning都是这么做的
，做不出来的才用TOPO。但你是TOPO都做不出来，就不知道为什么了。。。检查下你的
Taq是不是有问题吧。。。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 33 谢谢建议。很多你提到的我都做了，PCR reagent肯定没问题，因为同样的master mix
，加不同的
primer\template是可以P出产物的。另外这个endogenous plasmid不大，8kb不到，我
提了以后
跑过胶确认过。
有时候真的很不喜欢那些从别人实验室要来的材料啊。 |
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a*****g
发帖数: 543 | 34 protocol基本一样，purelink就是aim QIAGEN的kit做的一个系列。
没有做过head to head的comparison;只能说8kb左右的plasmid没啥问题 |
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z*****k
发帖数: 86 | 35 推荐Invitrogen的GENEART® Site-Directed Mutagenesis System
我一个8kb多的质粒做了10几个突变了
非常方便
HF |
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j****x
发帖数: 1704 | 36 同事之前收到别人给寄过来的质粒，已经是大提好了的。送测序公司简单测了一个反应
，匹配。
后来同事基于这个质粒又构建了其他几个衍生，测序据说也都啥没问题。后来再做酶切
时，顺便点了个质粒对照，结果问题来了。
单酶切，双酶切，片段大小都正确。单单这个未酶切的质粒对照，不是正常超螺旋质粒
应有的迁移速率快于线形片段的情形，反而显示条带还显著大于单酶切后的线形片段。
（质粒大小6.5kb，正常的超螺旋结构约3.5-4kb,而该未切质粒显示8kb）
同事今天找我讨论，想了半天没法解释。从来没遇到这种情况，确切地说很少做质粒对
照，单双酶切正确就完了。没想到还有这种情况，怎么解释？ |
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t*****z
发帖数: 1598 | 37 谢谢楼上各位，尤其是Chamgrape的方法，如果真的管用那太好了。我今天试了下一个
total RNA。一条亮带在0.8kb，一条暗带在1.4kb，乘以2之后勉强接近18S和28S的大小
了。粗略定量也许可以吧。 |
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e****p
发帖数: 354 | 38 Northern 已经看到基因的大小在11kb左右（用RNA LADDER)。
但但转录后 LONGRANGE PCR，扩增中间一段应该是8KB，用PFU扩出来只有最清晰的6KB
左右，重复了一次还是这样，百思不得其解。。。
此外如果CLONE 长练PCR产物，基因中如果有>4KB重复序列如何测序啊，每次只能测个
600-800, 引物设计也是问题。。。
请教各位大侠。 |
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c********d
发帖数: 75 | 39 我们实验室买了个cDNA克隆，中间有个点突变，没有别的公司卖正确克隆的。我觉得最
好的办法就是
做个site directed mutagenesis把这个点突变改回正常。老板非常不信任site
directed
mutagenesis，说是vector太长了（8kb的样子）会引入新的突变，要我从提RNA开始自
己做克
隆。这得多多少工作，我怎么也说服不了他。大家说碰到这种情况我怎么办？ |
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y***i
发帖数: 11639 | 40 不能在突变位点两边找到适当的位点切一下么？怎么都不需要把8kb都pcr吧。
我要是你就偷偷做了，一下子就完成的cloning。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 41 8kb?? 是从genomic DNA还是cDNA p？ |
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w******n
发帖数: 767 | 42 用质量好的酶，8kb完全没问题，我做过几十个这样的突变纠正。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 43 问题不在于好酶是否能够纠正突变，而在于你如何排除引入新的突变。即便理论上这样的
几率不大，但是为了确保万无一失，一般还是需要全长测序验证的。8kb，至少也是10
个反
应，时间，成本，都是问题了 |
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R******n
发帖数: 33 | 45 从基因组DNA里面分段扩exon然后拼起来 ：） |
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A*******e
发帖数: 284 | 46 我也一直觉得自己没有真正搞清楚这个连接比例的问题，正常的情况下比较好做克隆也
就不顾这些了，但碰到一些极端情况，如极大或极小的insert，就觉得难了。假若我不
告诉你那个是载体，那个是片段，告诉你需要将两个DNA分子连接起来，该取什么样的
摩尔比。
单梅切若载体不去磷酸化，基本没有成功的可能。最好双酶切的策略。这种8kb的片段
比较大，很难克隆的。 另外我觉得产物纯度很重要，尤其是胶回收的产物，每次测得
时候总发现260/230的比例不够理想，所以觉得这种回收产物最好不要加太多到连接体
系里面。实际上我也发现胶回收的片段加多了就会连接不好 |
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x********u
发帖数: 430 | 47 Is it possible that I insert a 6Kb fragment into a 8Kb vector? I have
repeated three times and have no luck geting any colonies. For construct
below 10Kb, I am very confident (>80%) and I can always get the right
transformants after screening. Is there any tricks for this big fragment
cloning? I know all my gene can be functionally expressed in E coli, so
there is no protein toxicity issue. |
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