s***m
发帖数: 6197 | 1 同意rutherford的说法
你按他的建议试试看先
～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
这个是要在不形成dimer的前提下
10mM |
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z***q
发帖数: 907 | 2 就是说结构不稳定主要是端基没有GC的原因了？
我曾经做过一个mutation,就是把端基的2个UU都去掉，再把邻近UU的AU变成GC，这样就
有2个GC连在一起，可以transcribe了。然后发现得到的样品dimer有大概30%-40%，这
是不是说明不仅stem,其实loop也不稳定？
非常感谢！
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
这个我感觉也没什么用 |
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r********d
发帖数: 58 | 3 这个问题要分两重看
第一，你加了GC之后，hirpin是比原来稳定了
第二，你加了GC之后新的序列形成的dimer可能比single hairpin更稳定，这个就和序
列有关了，没拿到结构，谁也说不太清楚，呵呵 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 4 引物的设计很重要。 GCcontent, hairpin, self-dimer这些都要考虑到。
Bgl2 |
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h*****o
发帖数: 342 | 5 很多GPCR都是dimer
我研究过一个叫PAR1的GPCR，它能被很多蛋白酶激活，像thrombin, APC, MMP1,
plasmin，等等。那同一个受体怎么能介导不同的信号通路呢？最近发现某些蛋白酶（
比如APC)是先结合到一些特异性的膜受体上(比如EPCR)，然后再就近切PAR1。所以你说
这种同类聚集的特异性是有可能的，也许还是必要的。 |
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r****i
发帖数: 323 | 6 J Recept Signal Transduct Res. 2010 Dec;30(6):372-5. Epub 2010 Aug 23.
On the roles of Mg in the activation of G proteins.
Birnbaumer L, Zurita AR.
Laboratory of Neurobiology, National Institute of Environmental Health
Sciences, NIH, DHHS, Research Triangle Park, NC27709, USA. birnbau1@niehs.
nih.gov
Abstract
In this review, we highlight the evolution of our knowledge about the way Mg
(2+) participates in the activation of heterotrimeric G proteins, beginning
with its requirement in hormonal sti... 阅读全帖 |
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k****o
发帖数: 589 | 7 引物应该没问题。一是melting curve形状接近完美，没有小肩峰，融解温度也正常。
另外设计的时候考虑到了dimer的问题，已经加以避免了。blast的结果表明这些引物顶
多和genomic DNA有部分序列吻合，和其他基因的mRNA序列都不吻合。
所以我在想会不会是机器的问题。不过机器的基线倒是挺稳的。用的SYBR Green,噪声
产生的RFU变化不超过正负100。 |
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g*****p
发帖数: 451 | 8 这年头做蛋白的人怎么这么多...
你这个蛋白问题挺大的，本来性质就不是特别稳定，不容易在溶液中单分散
由于你用了gst，所以使其溶解性能增加了
你的gst beads实际上是agarose尾巴上接14C左右的碳链
然后再锚定谷胱甘肽
你的蛋白如果疏水区外露的化，很容易就跟这些碳链骨架的beads搅合在一起了
所以你的gst能带着就尽量带着吧
不过gst是一个dimer，如果你的蛋白活性对聚集状态没有什么要求的化，就用这个好了
如果有要求可以换个mbp啥的
如果纯化出来除了做做pull down等等还有其他要求，比如mg啥的
最好还是做些mutant,truncation也行，fusion protein, 也行，把hydrophobic
residue
一路突变过去找个不影响活性又能增进其稳定性的亦可以
BTW:你这个蛋白我怀疑已经是soluble aggregate了，最好还是先不去除tag，把蛋白稍
微纯化一下，用gel filtration或是光散射看一下
soluble aggregate对你没啥太大意义了，就算测出来点活性。以后成文，你要在文章
里耍赖不提还好，一旦提到sol... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 2939 | 9 你不是跑的SDS-PAGE吗？理论上dimer应该不存在吧。 |
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v**p
发帖数: 15 | 10 应该不可能是dimer，而且这个protein有100kd 左右 |
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j****x
发帖数: 1704 | 12 没看见特地用单体蛋白这个限定词么？
按你的意思，蛋白质要么偶数个Cys且两两配对，要么奇数个Cys但形成dimer？你觉得
可能吗？酶活性中心的关键Cys咋办？ |
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b*****o
发帖数: 150 | 13 Sequence-specific DNA binding by covalently constrained peptide dimers of
the basic leucine zipper protein GCN4.
Bioorg Med Chem. 1995 Jun;3(6):777-84.
High Affinity, Sequence Specific DNA Binding by Synthetic Tripyrrole–Peptide Conjugates
b**********[email protected]
Thank you so much for your help! |
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R****n
发帖数: 708 | 14 Ct cutoff for real-time is 40. primer dimer will be a possible cause. You
shouldn't let it run that many cycles. |
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c******e
发帖数: 350 | 16 Thanks a lot! 但是TaqMan probe不是不会测到primer dimer么？
The Ct for the green curve samples got at 38. In another experiment a
negative sample gave a Ct at 36.
These 2 occurred very rarely (2/50). When I repeated it, 1/4 chance gave
negative result. |
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j*********o
发帖数: 237 | 17 本人新手，刚开始做chip-seq，不知道应该用single-read 还是 paired-end，好像说
paired-end做出来的peak比较准确，但是容易有primer dimer的污染，恳请有经验的大
侠指教！ |
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B*****e
发帖数: 1005 | 18 140后的几个也不是美国AP啊，文章比跟前几个有距离
140 黄亿华 男 1971年10月 中国科学院生物物理研究所 生命
科学 2004年02月毕业于[美国]康奈尔大学 [美国]休斯医学研究所/西南医学中
心 讲师
1: Huang Y, Smith BS, Chen LX, Baxter RH, Deisenhofer J. Insights into pilus
assembly and secretion from the structure and functional characterization of
usher PapC. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 May 5;106(18):7403-7. Epub 2009
Apr
20. PubMed PMID: 19380723; PubMed Central PMCID: PMC2670885.
2: Lin SC, Huang Y, Lo YC, Lu M, Wu H. Crystal structure of the BIR1 doma... 阅读全帖 |
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g*****d
发帖数: 27 | 19 所有方法都试过了，hot start, redesign primers, touchdown, low primer
concentration, change all the reagents...
昨天试了最后一种方法，design tailed primers, 再不成我就崩溃了
大家有没有好的建议？ |
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y******8
发帖数: 1764 | 21 Increase your template amount or use a plasmid as positive control. |
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y******8
发帖数: 1764 | 22 Did you try any control primers?
If not confidential, just paste the sequences of your primers.
Hard to believe that any properly designed primers could fail on plasmid DNA. |
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v***2
发帖数: 131 | 24 Hi, have you run minus RT? and have you checked the primer dimer? I dislike
the BioRad instrument too, it is not as stable as the Applied Biosystem |
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m*****z
发帖数: 1451 | 25 PAGE纯化的都不靠谱，最好是HPLC纯化的
pnk加磷酸不如直接合成带5'磷酸的oligo
这样基本上万无一失了，就是有点贵。
想省钱的还是合成2条primer故意让它们形成primer之间的dimer
PCR后酶切，跑个10%的non-denatured的PAGE，切胶后碾碎，用TE泡1小时或过夜，乙醇
沉淀，记得加点离子。
HPSF |
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b****r
发帖数: 17995 | 26 说错的地方大家指教
这个人第一个找到了TLR4 和Lps的关系，让Yale几个做免疫多年的人极不爽。yale的innate
immunity在一代宗师Charles Janeway的带领下出了一群牛人，进去的faculty自动就是
HHMI， Toll like receptor 家族里另外几个的配体都是Yale做出来的。话说TLR4其实
Janeway和他的天才俄国博后Medzhitov先做出来的，beutler的文章是98年出的，
Janeway 97年就发了文章，只可惜他并没有找到TLR4的配体，只是强行dimerize 俩
TLR4constitutively激活了TLR4和下游的反应。
Beutler做出这玩意后，就开始加入innate immunity这个小圈子。圈子里的会议那时候
主要还是Yale那一派把持，说怎么个不是正儿八经innate immunity的家伙到我们这里
招摇来了？据说在那些年很是给他穿了几年小鞋。不过这哥们虽然用的是这种奇怪的招
数，但是功利实在太深厚，钱实在太多，接下来的东西一篇一篇出，Yale免疫那几个
HHMI拍马都赶不上。
这次这哥们竟然靠i... 阅读全帖 |
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b****r
发帖数: 17995 | 27 说错的地方大家指教
这个人第一个找到了TLR4 和Lps的关系，让Yale几个做免疫多年的人极不爽。yale的innate
immunity在一代宗师Charles Janeway的带领下出了一群牛人，进去的faculty自动就是
HHMI， Toll like receptor 家族里另外几个的配体都是Yale做出来的。话说TLR4其实
Janeway和他的天才俄国博后Medzhitov先做出来的，beutler的文章是98年出的，
Janeway 97年就发了文章，只可惜他并没有找到TLR4的配体，只是强行dimerize 俩
TLR4constitutively激活了TLR4和下游的反应。
Beutler做出这玩意后，就开始加入innate immunity这个小圈子。圈子里的会议那时候
主要还是Yale那一派把持，说怎么个不是正儿八经innate immunity的家伙到我们这里
招摇来了？据说在那些年很是给他穿了几年小鞋。不过这哥们虽然用的是这种奇怪的招
数，但是功利实在太深厚，钱实在太多，接下来的东西一篇一篇出，Yale免疫那几个
HHMI拍马都赶不上。
这次这哥们竟然靠i... 阅读全帖 |
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n****0
发帖数: 696 | 28 有些manual上建议3‘端用G or C,可是用软件设计的引物末端经常是AT，稍微改一下
rating就会变得很低，因为hairpin，dimer之类的，这种情况我是应该完全相信软件，
还是确保末端是GC更重要啊？ |
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b******y
发帖数: 627 | 29 If you still see some full length product, put a His tag at the C-terminus.
Using Ni first and then glutathione sepharose next. You will produce some
good stuff. Due to dimeric nature of GST, it is still not ideal.
If you can, make a MBP-YPI-His. Using Ni first and Amylose second, you will
get pure protein. And the yield can be enhanced as well.
Good luck! |
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H*g
发帖数: 2333 | 30 Does Maltose Binding Protein tag also have the dimerization issue?
In his case, I guess he needs to determine whether his protein really got
expressed or not, before considering any possibility of degradation, etc.
.
will |
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f***l
发帖数: 1157 | 31 比如溶液里一种蛋白可以形成monomer，dimer，trimer等等，如何从分子量（或大小）
的角度测量各个聚集体的比例
谢谢~~~ |
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s******s
发帖数: 13035 | 32 dimer应该size selection去掉的啊。有篇paper还有用LNA probe，
把这个pull掉，比较适用小片段 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 一篇 just from HHMI PI group
//www.hhmi.org/research/investigators/kuriyan_bio.html
then accepted on CNS 罢了
Even Times Cited: 365 (from ISP Web of Science)
Title: Crystal structure of a tyrosine phosphorylated STAT-1 dimer bound to DNA
Author(s): Chen XM; Vinkemeier U; Zhao YX; et al.
Source: CELL Volume: 93 Issue: 5 Pages: 827-839 DOI: 10.1016/S0092-8674(00)81443-9 Published:
MAY 29 1998
*******
But compare to 伽罗瓦的last 手稿
it is just a 水文
please refer:
21岁的伽罗瓦，200岁的群论
2011-07-29
他比牛顿更个性，... 阅读全帖 |
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s*****g
发帖数: 87 | 34 For qPCR, primers need to be specially designed to avoid the formation of
primer dimer and smear.
you can try the primer designing tool from IDT and redesign your qPCR
primers, which are the most important thing for a successful qPCR.
http://www.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/ |
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l*****5
发帖数: 197 | 35 大家好，现在遇到一个问题不知道怎么解决，希望在此得到帮助，不甚感激！
我用recombinent protein 做一个in vitro assay，最终希望得到一个比较纯，浓度比
较高的dimer，所以一个是His tag，另外一个是GST tag，计划用两次纯化得到最终产
物，其间涉及到另外三种enzyme,实验室以前别人做的，都是His tag。
按理说，整个反应的过程没有多大难度，有一些文章也有receipe，但因为我需要的是
最终的产物，然后再接着往下做别的，所以希望能做的多一些，也需要浓度大一些。但
我已经试了3、4次了，基本上每次做都会缓慢的出现絮状的沉淀，就好像蛋白变性的那
种感觉，会不会是我用的反应浓度比paper上的浓？但我需要的量比较大啊。。。lab以
前的师兄做过，效果还可以，我的浓度是他的5倍，而且总体的量也多很多，他以前做
的量都比较少，也不需要纯化之类的，师兄毕业走人了，而且他一直就用比较稀的浓度。
还有，我试着将离心后的上清过Thermo Pierce的glutathione agarose beads,可以看
到蛋白有吸附（有YFP tag），但我最后... 阅读全帖 |
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N2
发帖数: 81 | 36 primers:
Forward primer: the matched part should be 30-35mer, tm~65C,
Reverse primer: should be >30-35er, could be 40-55mer if you don't have a
tail, the long the better, matched base pairs have tm around 65.
cycles:
using phusion polymerase, add 5% DMSO(2.5ul/50ul), annealing temperature>=
68C.
For the long primer pcr, the main problem is the primer dimer and the second
structure of the primer. So you need a long matched length to give space to
increase the annealing temperature and break any p... 阅读全帖 |
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e****s
发帖数: 1125 | 37 觉得你提的更可能是Trash，不是你的目标质粒。
重新来吧。 |
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s*****a
发帖数: 59 | 38 要做qRT-PCR检测一个gene expression level，请问negative control Ct要比sample
Ct大多少才能接受？我要检测一个gene的alternative spliced isoform，其中一个
isoform 1 的扩增结果会被平时用的plasmid污染，另一个 isoform 2 可能会受
genomic DNA污染。如果检测isoform 1，RT minus control的Ct value只比样品晚3个
cycle（Ct sample=26, Ct RT minus control=29, Ct GAPDH=17），相当于污染物是样
品target gene的1/8，这个污染程度能否接受？
另外我的total RNA做过turbo DNase digestion，如果要检测可能受到genomic DNA 污
染的isoform 2, 请问RT minus control的Ct值比样品大几个cycle才能接受?
补充一点，negative control melting peak已经确定不是primer-dimer而是target
ge... 阅读全帖 |
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g*********3
发帖数: 177 | 39 好帖~
1）我前几天在想personal medicine，我们是不是策略可能有点问题~ 通常的做法是
find a commonly occured desregulated pathway based on many samples---Find
drug---Treat people carrying this abnormal pathay with drug.
其实由于heterogeneity，找出癌症共有的通路本身就是很难的【这个可以部分解释为
什么microarray做了这些工作，取得的效果不是很明显】~ 我的想法是直接进入
personal medicine，忽略第一步，直接进入第三步不见得难~ 当然这个成本目前还不
可能被接受~
2）LZ说的第二点很好~ 我个人的观点是怎样从这么多mutation中找出driver mutation
，这个面有不少牛组在做了，进展不是很大，另外有人提到了一点，很多不是
druggable的，这个比较棘手，很多TFs，我估计是driver mutation，恰好很多TFs不是
druggable的，这个是老板的经验，他说可能和TFs ... 阅读全帖 |
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b****r
发帖数: 17995 | 40 1.直接personal我觉得是不现实的。怎么个peronalize，你怎么找切入点？人的一辈子
，除了DNA是相对稳定的，其他的东西变化太厉害，对于科学研究来说可以说是个相当
捉摸不定的东西
2.大牛组进展不大很正常，现在遗传学技术的通量对于癌症的复杂程度根本差得太远太
远，说九牛一毛也不一定夸张了。至于是不是drugable，也不好一概而论，但是我觉得
原则上只要癌症和正常细胞还有本质的区别，它就一定有致命的靶点
3.microarray就别提了，太逊了。我反复强调的一点，就是有没有可能穷尽一个东西。
只要能穷尽地研究一个东西，这个东西就能被搞清楚，这是我的信念。microarray只能
针对一部分基因的很小一部分信息，说它挂一漏万，肯定没有夸张。 proteinomics理
论上当然好，但是刚才我说过，蛋白变化太大，而且即使一个细胞里不同蛋白都可以有
无数种位置区别，不同的化学修饰，再加上和另外几十几百个protein的互作，然后人
体有几亿亿个细胞，现有的人类技术不知道要多少年才能穷尽。我觉得这是一条低效率
的路。
4.癌症致死，归根结底是癌细胞越来越多。
1）我前几天在想p... 阅读全帖 |
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t*d
发帖数: 1290 | 41 多谢。
今天看了一片zhang yi 的老综述。这个 histone marker 怎么在细胞分裂是被复制的
机理还不是很清楚。
里面提到 H3/H4 dimer 可能比 H3/H4 tetramer 更稳定。这个倒是个好的蛮好的解释
。可惜被证伪了。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 42 通俗点讲
Brain Tumor Cytoskeleton Dynamic Microtubules likes Tublin Myosin Action etc
. projects
要借助数学 和工程计算学 生化学
药学 医学 至少 5 个实验组的co-Fundings.
比如以下 生化数学计算方面的 论文
Margolin G. at al. (2012)
The mechanisms of microtubule catastrophe and rescue: implications from
analysis of a dimer-scale computational model
Mol Biol Cell. 23: 642-56.
link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22190741
引用它的论文 是应用药学方面的
Bouazza N et al. (2011)
Population pharmacokinetics and pharmacodynamics of cysteamine in
nephropathic cy... 阅读全帖 |
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l********e
发帖数: 415 | 43 必然需要real-time
就跟楼上说的一样 比如你两对引物A B A效率高 B效率差
肯定可以在某个cycle
看到
A产物已经接近饱和(ct曲线上面 看不出差别）
B产物还没有饱和(ct曲线中间 容易看出差别）
另外 更严谨一点 你sequence了PCR product么 ... 怎么知道产物不是dimer或者其他
什么乱七八糟的东西 |
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w***7
发帖数: 1637 | 44 source：http://bbs.netbig.com/thread-2491712-1-2.html
看了一下，今年不错啊，和清华并驾齐驱。
而且下半年我知道的还有两篇NS。
~~~~~~~~~~~~~~~~~
1.
Yuan W, Wu T, Fu H, Dai C, Wu H, Liu N, Li X, Xu M, Zhang Z, Niu T, Han Z,
Chai J, Zhou XJ, Gao S, Zhu B
Dense Chromatin Activates Polycomb Repressive Complex 2 to Regulate H3
Lysine 27 Methylation
Science, DOI: 10.1126/science.1225237, Aug. 24, 2012
2.
Liu B, Du H, Rutkowski R, Gartner A, Wang X
LAAT-1 Is the Lysosomal Lysine/Arginine Transporter That Maintains Amino
Acid Homeostasis
S... 阅读全帖 |
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R****n
发帖数: 708 | 45 METHYL-SEQ送去core facility一年还没有结果，最近一次F５和BARCODE都没有问题，F
３LIGATION ３个CYCLE就没有信号好了。NANODROP和跑胶都确认LIBRARY没有问题，也
没有PRIMER DIMER。用的是SOLID 5500系统。 |
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m******p
发帖数: 67 | 46 western for a 25kd protein. using serum.
but the band is clearly at 50kd.
seems dimer, but in sds-page, proteins are denatured, so should not form
dimmer. any suggestions?
thank you very much. |
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a*********n
发帖数: 2526 | 47 for some dimers, SDS is not enough to fully disrupt it. |
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m******p
发帖数: 67 | 48 i boiled it for 5 min.
a website says no boiling can remove dimer, so i tried no boilding, but
still the same result. |
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f******9
发帖数: 39 | 49 How about -S-S- linked dimer? |
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g***x
发帖数: 645 | 50 要看二聚体,做个low temperature 的western, 用的SDS PAGE, 不用任何reducing
agent, 为了避免二聚体打开,样品不煮,整个过程４C
3,4 是正常对照, 煮沸的, 加reduce agent看到清晰的单体, 没有二聚体.
1,2 是 低温下做的, 看到二聚体,也看到 一部分单体,
现在的问题是, 二聚体的带不集中,弥散开很多,
考虑原因,
可能是因为 没有reduce, 但SDS 会起到一定打开三维结构的作用,所以,dimer 虽然是
同样的分子量, 但是形状应为蛋白去折叠的程度不同而不同, 导致泳动速度不均一, 如
果是这个原因, 不知道可以用什么方法解决 多加 SDS 不知道可以可以?
还有可能是因为ＳＤＳ插入的多少不均一,造成泳动速度不均一?
麻烦大家讨论讨论,高手指点指点 |
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