g***x
发帖数: 645 | 1 弥散得有点太厉害了 文献里头的都不这样,
这样的图发不了啊,
room temperature 很可能不ok,dimer 会被打开, 不过4C会是造成弥散的原因么? |
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l***y
发帖数: 4671 | 2 不加 SDS 的话，电泳主要靠蛋白质自己的电荷量，还要保证负电荷为主，需要 pH 高
于所关心的蛋白质的等电点。带的位置和蛋白质大小也没有严格的关系，要靠
antibody 来标记。同时因为电荷量不够，蛋白质会 aggregate，所以对 detergent 的
浓度很敏感。
SDS 主要靠长烷基链的憎水性来和憎水的蛋白链结合，所以会 denature 掉蛋白质，破
坏靠范德华力维持的 protein association。可以考虑用一系列浓度不同的低浓度 SDS
处理 sample 跑电泳，看 dimers 带的变化，做曲线再外推。这个方法还是对
detergent 的浓度特别敏感。而且外推的曲线很不直。。。
还可以考虑一些不会显著 denature 蛋白质的引入负电荷的办法，比如说 Coomassie G
-250 据说只会在 protein 表面引入负电荷。一直想试。哪位试过，谈谈感受？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 3 Re; Cosimo2014 (柯希莫)
两重串联Mass 乃至傅立叶变换 三重串联Mass 和传统Mass的分析蛋白质的区别是
后者只有分子量的定性 和相对稳定同位素标示后的比如 SILAC Mass的定量
而前者 可以测 wild pH (NH4)2 SO4 溶液 pH 6.9 中的蛋白 二级结构 数据 乃至
dimer trimer etc. 三级结构数据
please go to below link:
//www.findnano.fi/fi/NanoCrmEquipment:UserView/id/1431
only some titles are Finnish
for example:
Tärkeimmät spesifikaatiot:
(NB: Key Specifications by //translate.google.fr/?hl=fr/
from Finnish to English bla bla bla...)
then almost rest is english:
Multistage MS (MS3 gua... 阅读全帖 |
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K*F
发帖数: 120 | 4 请您转发 z******[email protected]
万分感谢！祝您身体健康，财源广进！
Biochim Biophys Acta. 1988 Apr 28;954(1):1-13.
The inducible trimethylamine-N-oxide reductase of Escherichia coli K12:
biochemical and immunological studies.
Silvestro A, Pommier J, Giordano G.
Source
Laboratoire de Structure et Fonction des Biomembranes, CNRS, Marseille,
France.
Abstract
The inducible trimethylamine-N-oxide reductase which migrates on non-
denaturing polyacrylamide gels with an RF of 0.22, has been purified from
the soluble fraction o... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 6 为什么一定是“GST-protein过分子筛”？ |
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t**l
发帖数: 109 | 8 请问一下gel filtration 能给出什么定量的结果吗？ 能具体的说明哪块elute是多少
kd. |
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s*********y
发帖数: 292 | 9 有gel filtration的marker卖的 |
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p*****e
发帖数: 93 | 10 after purification, you cleave the GST off. |
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y******n
发帖数: 8667 | 11
找篇文章看看吧，看怎么确定分子量。一般加对照。 |
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t*****2
发帖数: 213 | 12 最直接有力的证据，也是最常用的方法就是跑变性和非变性胶。 |
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g*****p
发帖数: 451 | 13 你可以用接近10种方法来证明
但是无偏的方法学还是纯化蛋白后用静态光散射和超速离心来鉴定 |
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g*****p
发帖数: 451 | 14 X光测定可不能证明二体结构
最多可以说明其相关性 |
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C********4
发帖数: 308 | 16 不boil的是不是还不能加DTT啊
是否还需要一块非变性胶 |
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o****e
发帖数: 1011 | 17 嗯。得到pure的样品后，看方便用到什么设备了。
以前所在的化学实验室是利用Size Exclusion Chromatography(Gel Permeation
Chromatography) with online Multi-angle light scattering detection.
做Analytical Ultracentrifugation的话就得送外面专门的实验室了。不过这个
实验时间很长，样品的稳定性是一个需要考虑的问题。 |
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H*g
发帖数: 2333 | 20 Sorry couldn't type in Chinese here.
Was the result from this analytic method published?
Did the reviewers buy it? |
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z***g
发帖数: 28 | 21 Hey guys
I am doing purification of membrane proteins to get enough concentration for
NMR study, the protein was labeled by his-tag
Firstly, the protein was expressed by E. coli, lysed by several enzymes,
agents and detergent(empigen) to solublize everything, then it was purified
by Ni-NTA column, the protein shows at the right MW(about 18KD) at commassie
blue stained gel.
However, the problem is, after the second purification---ion exchange on
Capto Q(pH 8.0), the protein which we collected doe... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 左边那个貌似dimerization,
右边那个有可能是磷酸化
with |
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i***l
发帖数: 1656 | 23 左边那个貌似dimerization, --------as long as the target is transmembrane
protein |
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l****j
发帖数: 70 | 24 以前试过IP了，IP的过表达蛋白质的HA-tag，IB的我第一个图贴的抗体,分子量都在25
左右，但是这俩蛋白质一个在内质网一个在线粒体，不知道怎么binding到一起的，
如果直接在PVDF膜上测序，能得到可靠的数据吗？ |
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j*****q
发帖数: 82 | 25 sybr green的方法。primer express设计的引物， 没hairpin，没dimer，在载体上扩
增很漂亮，线性化也很好。但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
很接近，而且都偏大，28，29的水平。
这样的现象能是什么问题呢？引物本身的问题吗？
多谢了 |
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s******e
发帖数: 163 | 26 用命令行的 primer3
Primer3 picks primers for PCR reactions, considering as criteria:
o oligonucleotide melting temperature, size, GC content, and primer-dimer
possibilities, |
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z********i
发帖数: 610 | 27 多谢。我还有一个问题请教。如果tyrosine的-OH和R的侧链氨基是5.5A，那么tyrosine
被磷酸化以后，他们之间能相互在用吗？
因为手上有个蛋白能磷酸化激活，但是不知道机制，它的晶体结构已知，所以我想看看
是不是dimerization激活它。
Thanks |
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z******i
发帖数: 120 | 28 楼主，你的这些TAG基本没什么用，除非你的蛋白非常小。能说一下你现在用的蛋白
DOMAIN多大吗。
GST 对小蛋白非常有用，但大点的就作用有限，有时候还有副作用（因为是DIMER有聚
集效应）。 由于是DOMAIN，很有可能暴露HYDROPHOBIC区域，造成AB蛋白假结合或者聚
集沉淀。但希望不是这样。既然有文章支持结合，那结合还是比较靠谱的。100KD 应该
还算可以，主要你的表达怎么样。
个人建议用MBP（较弱，首选） 或者NUSA,先让你的蛋白不沉淀了再说。另外试试统一
BUFFER， 你AB能用同一种BUFFER吗，如果能，试试吧。在选择CONSTRUCT的时候要仔细
一点比较好，省得后面遭罪。至少要做个2D的ALIGNMENT 和结构的大概预测，相信楼LZ
已经做了。不能打破二级结构是最起码的要求。另外你的蛋白是否正确折叠是个问题。
多做几个CONSTRUCT的备选，费不了多少时间的。
如果经常做蛋白的DYNAMIC，就会对这个对照非常敏感。这里面肯定是有很大不同的。
虽然不太认为是造成你问题的原因，但简单的试一试也无妨。
对，这是终极方法。
现在俺很关注您的这个问题，后... 阅读全帖 |
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c********u
发帖数: 250 | 29 PCR tdtomato 总是有两条带, 大的1400多是对的,小的差600多,我知道tdt是dimer,可
是tdt 5' 3' 各有21和24bp是unique的啊,我用的就是这些primers,肯定不包含在重复
的那部分里,为什么还有两条带呢? PCR条件,62-55 touchdown,普通taq. |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 对于SYBRGREEN， 你能在胶上看到的东西，机器也都能看到。
所以这个很可能就是primer dimer 引起的。
我看了一下你用的condition, 建议你降低引物浓度，并升高温度（我会用至少55度吧
）。因为在比较高的温度下读荧光的时候，引物的荧光会小很多。 |
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n*********m
发帖数: 38 | 32 Immunology Retraction Exposes Misconduct
07/10/2013 Andrew S. Wiecek
Nature retracts a 1994 paper after the first author was found to have "most
likely" committed research misconduct. Learn more...
Last week, Nature retracted a highly-cited paper published in 1994 because
the authors were unable to reproduce the results, according to the
retraction notice (1). But the real reason behind the retraction might have
more to do with the first author’s scientific misconduct.
Nature has retracted a 19... 阅读全帖 |
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n*********m
发帖数: 38 | 33 mmunology Retraction Exposes Misconduct
07/10/2013
Andrew S. Wiecek
Nature retracts a 1994 paper after the first author was found to have "most
likely" committed research misconduct. Learn more...
Last week, Nature retracted a highly-cited paper published in 1994 because
the authors were unable to reproduce the results, according to the
retraction notice (1). But the real reason behind the retraction might have
more to do with the first author’s scientific misconduct.
Nature has retracted a 199... 阅读全帖 |
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e****s
发帖数: 1125 | 35 Just a guess,
Is it possible:
These peptides are dimers or oligomers at high concentration, which can't
bind the targeted protein. At low concentration, the oligomers dissociate to
monomer, which can bind. |
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s******a
发帖数: 472 | 36 我觉得Tm没有什么问题
你的F和R直接应该有dimerization的可能
AAAAA TTTTT
不知道能影响多少 |
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e********r
发帖数: 147 | 40 唔，这17个aa不在tansmembrane helix里头，而是正好在膜向着胞质的那一头。这个受
体形成dimer是天生的，我们怀疑17个aa形成的helix可能在识别到ligand后，会扭得更
厉害。
NMR |
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d******1
发帖数: 709 | 41 08和09年，有一个俄国的实验，连续发了3-4片JBC， JMB， BiophysicalJournal 文
章解析single transmembrane helix of Eph A4, ErbB2 and others 的文章，he
solved the monomeric and dimeric structures of these proteins.基本上半年一片
。而且实验花费极少 （俄国毕竟没钱）。 现在6年过去了，这种实验只会越来越简单
。 |
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d******1
发帖数: 709 | 42 08和09年，有一个俄国的实验，连续发了3-4片JBC， JMB， BiophysicalJournal 文
章解析single transmembrane helix of Eph A4, ErbB2 and others 的文章，he
solved the monomeric and dimeric structures of these proteins.基本上半年一片
。而且实验花费极少 （俄国毕竟没钱）。 现在6年过去了，这种实验只会越来越简单 |
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x********e
发帖数: 35261 | 43 很多蛋白不光是水解个ATP就完了的事
比如说V-SNARE和t-SNARE怎么互相识别dimerize的，motor protein怎么就在水解ATP后
发生构象改变了，光解个kinase domain解决不了问题。还有些intrinsic disordered
protein或者protein domain，根本无法用静态结构去理解。比如核孔蛋白含的FG doma
in。 |
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e********r
发帖数: 147 | 44 谢谢啊，很多信息。结构主要是我们这种实验室也不会做。你说的其它方法我先查下文
献，消化一下......。 |
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U*****t
发帖数: 19 | 46 using bivalent ligand sounds a great idea. |
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e********r
发帖数: 147 | 47 Bimane，新名词。谢谢，我去学习一下......
GPCR |
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b******y
发帖数: 627 | 50 What kinase? Histidine kinase? |
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