m**********d
发帖数: 137 | 1 原来用agarose beads做IP，最后recover protein的时候，加loading buffer到beads
里煮一会。现在第一次用Invitrogen的Dynal beads，请问大家都怎么elute protein下
来呢 |
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m**********d
发帖数: 137 | 2 IHC及IF显示蛋白A在tumor cell的细胞核里高表达，蛋白A的canonical function是与
蛋白B bind并激活B。一些preliminary data提示蛋白A有新的功能，就是与蛋白C
bind而调控另一个重要的生物过程。
现在需要得到A与C直接作用的证据，下面这个用Dynal magnetic beads做CO-IP的
protocol：
10μl Dynal beads coated with protein A+10μl Dynal beads coated with
protein G each reaction, wash with ice cold PBS plus 5% BSA, three times.
Incubate with antibody against 蛋白A (20μl, approximately 4μg) in 500μl
PBS plus 5%BSA, overnight.
2^106 cells/10cm plate, treatment (which induces A and C interaction while
... 阅读全帖 |
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z*******a
发帖数: 175 | 4 try Dynal magnetic beads
Dynal magnetic beads saved my IP life |
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m*********k
发帖数: 10521 | 5 "【Olympics】
qia Aug 13 ● 伦敦奥运金牌数竞猜合集"
成功奖励 288 伪币的用户: ADSP
成功奖励 158 伪币的用户: buzhoushan, lxinzhe
成功奖励 50 伪币的用户: dendron, mir, ridgway, SmileS, painkiller
成功奖励 10 伪币的用户: zli, crabghh, nn2, lin123, mimi123, defire, tosea,
wmxz, mahjong, wsn1900, Acartia, iloveny, swineustc, DoMyBest, chehu,
wgyeric, Iapetus, Gneissee, amy88, yaoo, qwerty12, shallow, renyi, parrot,
pdh, Huffman, leedg, sunfish, dg22, Discrete, helloterran, wpcui, xxhh,
happybaby135, hammy, michellezhao, lwin, hardier, allbl... 阅读全帖 |
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q*a
发帖数: 2330 | 6 同主题阅读：[合集] 伦敦奥运中国队金牌数竞猜
[版面:奥运版][首篇作者：qia] , 2012年07月28日01:58:17
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qia
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发信人: qia (恰恰·伦敦奥运倒计时), 信区: Olympics
标 题: [合集] 伦敦奥运中国队金牌数竞猜
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 28 01:58:17 2012, 美东)
☆─────────────────────────────────────☆
qia (恰恰·伦敦奥运倒计时) 于 (Wed Jul 18 14:21:56 2012, 美东) 提到:
象上次一样，来个中国队金牌数竞猜吧.
直接回此贴. 格式如下
金牌总数：
奖牌总数(tie breaker):
前三名有大包子哦.
截至日期是开幕式结束后
☆─────────────────────... 阅读全帖 |
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q*a
发帖数: 2330 | 7 一个第一，两个并列第二！ 都很接近啊！
ADSP: 38/87
buzhoushan: 38/86
lxinzhe: 38/90
dendron: 38/96
mir: 38/98
ridgway: 38/76
SmileS: 38/102
painkiller: 38/102
以下参与的同学也会获得一个包子
zli, crabghh, nn2, lin123, franey,
sighfromsoul, mimi123, defire, tosea, cnnssb,
denver, wmxz, mahjong, wsn1900, Acartia, iloveny, oudeshen,
zblgaoxin, swineustc, DoMybest, chehu, Franlindou,
emmac, wgyeric, Iapetus, Gneissee, amy88, zyzha0924,
dynal, yaoo, qwerty12, shallow, renyi, parrot, llin,
whatwhenever, pdh, Huffman, leedg, sunfish, dg... 阅读全帖 |
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s*****i
发帖数: 5548 | 8 ☆─────────────────────────────────────☆
gagaga (gagaga) 于 (Mon Nov 26 17:08:58 2012, 美东) 提到:
RT.
Houston的兄弟姐妹有没有好的炒菜锅推荐。
☆─────────────────────────────────────☆
bjjasmine (茉莉) 于 (Mon Nov 26 17:52:38 2012, 美东) 提到:
看你要什么样的
我在calphalon买的不锈钢炒锅还不错
☆─────────────────────────────────────☆
anywhere (早已经习惯一个人难过) 于 (Mon Nov 26 18:08:41 2012, 美东) 提到:
回国扛一个苏泊尔铸铁锅过来
☆─────────────────────────────────────☆
yapple (稳似泰山共携手，陶然一笑友情深) 于 (Mon Nov 26 21:52:08 2012, 美东) 提到:
大华有一款韩国产的不粘锅很不错。HMart... 阅读全帖 |
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d*****e
发帖数: 2684 | 9 ☆─────────────────────────────────────☆
roc999 (James Bond) 于 (Tue Feb 18 01:24:11 2014, 美东) 提到:
missladybug在complain版发起了弹劾版主的提案，欢迎德州版友发表意见。
请去complain版原帖下面支持或反对。
http://www.mitbbs.com/article_t0/Complain/31324589.html
我当初出来做版主就是看到德州版长期没有版主乱作一团。我也没说我做的perfect,
做的不合适的地方肯定有。当版主肯定是要被骂的，肯定是要被投诉的。mitbbs上面不
可能让所有人都满意。
现在给你的选择是：
1. 你要是觉得希望我继续干一段时间，删删污言秽语帖子，封封PA的ID，删删坑王造
谣的帖子，发病毒的帖子，自恨讽刺华人的帖子，尽量保持版面秩序的话，请去那个帖
子回帖支持版主留任。
2. 你要是觉得我应该下台，请到那个帖子回帖表示版主下台，足够多的本版常驻ID觉
得我应该下台我就下台。 爱谁谁。
兄弟说了的周末办枪械安全讲座的事情不受这个... 阅读全帖 |
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o*******n
发帖数: 2035 | 10 特别感谢James大牛，他的贴都是含金量极高的营养贴，无私分享他的心得和新技术，
希望果农们学习领会勇于探索，把嫁接技术好好地掌握。
2017年10月gardening版共414贴
排名 ID 帖数 忠诚度(排名) 引用数(排名) 引用率(排名)
1 notjames 31 100.0% (1) 15 (1) 0.48 (30)
2 jmzjmz 30 56.6% (37) 2 (19) 0.07 (42)
3 oldgordon 23 100.0% (1) 12 (2) 0.52 (15)
4 watermore 14 93.3% (31) 9 (4) 0.64 (10)
happybaby 14 93.3% (31) 6 (5) 0.43 (31)
6 majiaabc 11 22.9% (42) 6 (5) 0.55 (14)
7 oakfarm 10 ... 阅读全帖 |
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n*****e
发帖数: 119 | 11 用biotin标记的dna就好了。我前一阵子试过，不过没有继续。据我了解dynal beads还
行，但是他们的人没有太关注rna。还有个macs什么的公司，有专门的kit。不知道效果
如何。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 12 我一直用invitrogen的Dynal beads，不过没比较过别家的，不知道是贵还是便宜。我
觉得不便宜就是了。magnetic beads肯定比普通的beads方便，损失也小一点。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 13 我做30min的incubation.
我用的是dynal beads，应该没有到nano的级别吧，估计微米级？
binding efficiency我就是测一下binding前后的UV差值。我做得没那么精细，就是毛
估估差不多就好了，反正是library，多一点少一点看不大出来。。。
incubation |
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w******e
发帖数: 1187 | 14 en dynal beads are at um level. maybe I should try that too...
I don't have much biotinylated oligo to begin with, so UV won't be accurate
for me... |
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T**********t
发帖数: 1604 | 17 Streptavidin-biotin的binding特别强，不变性弄不下来，所以没法重复使用。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 18 其实一个biotin跟SA的binding ms没想象的NB。我把biotinylated aptamer
coat到SA beads上做过sandwich assay，结果发现heat后掉下来的
aptamer造成极大background。杯具。。。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 19 我没做过单biotin label的，都是直接上dual biotin，结合得很牢靠。跑PCR都没问题。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 21 我的assay是biotin RNA beads+protein +unlabeled alternative RNA,
要elute unlabeled RNA的话除了heat外有什么比较保险的方法吗？
0.1M NaOH? |
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w******e
发帖数: 1187 | 22 有什么好办法往RNA上label多个biotin否？
题。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 23 估计不行，RNA容易被NaOH溶液水解。
我没做过这个assay，暂时能想到的也就是给biotin-RNA弄上个dual biotin label，让
它抓得更牢一点。在IDT合成的RNA是可以直接订带dual biotin label的，但是如果要
自己在实验室label的话我就不知道了，应该有kit买的。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 24 俺的RNA巨长，还是2'F modified，合成要成千上万刀。。。杯具。。。
我买的kit只能label一个biotin。。。anyway，其实也可以改一下primer sequence
能distinguish labelled/nonlabelled RNA就行，我就是懒。。。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 25 巨长是多长？太长的话你可以买一段短的RNA然后跟你的长的RNA片段ligate起来。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 26 SA应该是4个domain？一般都是多biotin,想想pKa*4,恐怖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 27 为啥会有unlabeled? 是指background么？
w |
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s******s
发帖数: 13035 | 28 换其他的kit? 不是biotin-UTP一类的么？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 29 80base。
嗯，我把splint ligation的东西都买了，就是懒得做。。。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 31 unlabeled RNA binds to different site on the protein (hence the sandwich),
and is measured w/ qRT-PCR for read out. However, my labeled aptamer
has the same primer. hence the 杯具。。。其实主要是一直就没想到biotinylated
RNA会fall off，troubleshoot了好久。。。 |
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B*****e
发帖数: 1005 | 33 为什么Co-IP不推荐用dynal beads |
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y*********u
发帖数: 183 | 34 能推荐一款kit配合dynal进行chip用么？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 35 Thank you much for your great contribution to my rookie question^^
I think non-related region negative control is convincing theoretically, if
not taking non- specific DNA precipitation into account: different DNA
region might have different tendencies of non specific precipitation (I also
learned that this issue can be simply avoid by using dynal beads)
A parable phenomenon is that when I was doing invitro protein interaction
assay such like GST pull-down and co-ip, the reviewer did not questi... 阅读全帖 |
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y*********u
发帖数: 183 | 36 正在做一个TF的chip
用的dynal beads
产物沉淀后（看不见沉淀，只是小心地避开估计有沉淀的区域），用水溶解，用
nanodrop一测浓度达到260ng/ulX60ul, 非常奇怪，首先，一般最后不可能收到这么多
DNA，其次，如果真的收到了这么多DNA，那一般就能看见沉淀了（9ug的DNA必然是能看
见的……）
另外，补充一下，用同一个抗体的目的基因knock out细胞系也能测出这么多DNA |
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s******r
发帖数: 2876 | 37 Phenol contamination?
正在做一个TF的chip
用的dynal beads
产物沉淀后（看不见沉淀，只是小心地避开估计有沉淀的区域），用水溶解，用
nanodrop一测浓度达到260ng/ulX60ul, 非常奇怪，首先，一般最后不可能收到这么多
DNA，其次，如果真的收到了这么多DNA，那一般就能看见沉淀了（9ug的DNA必然是能看
见的……）
另外，补充一下，用同一个抗体的目的基因knock out细胞系也能测出这么多DNA |
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d****7
发帖数: 109 | 39 嗯，能，连上反而更好，我用Sigma V5-10 Mouse monoclonal Ab，这抗体是IgG1，与
protein G结合拒差，我就用DMP把V5定到protein G上，然后IP效率奇高。
后来我不想每次做IP都crosslink，所以就换了一个beads，叫Dynabeads Pan Mouse
IgG，这个beads能与各型mouse IgG的Fc段结合，结合力很高，不是做广告，确实不错。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 40 可以给个链接的protocol吗？谢谢。
错。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 41 看的头昏眼花，有这么复杂吗？我的做法
直接用dynal protein G.
裂解细胞（裂解常用的detegent有tritionx100,NP40,chaps)
裂解液的配方要自己摸。看看文献蛋白A 别人用什么条件作ip。
用PBS洗珠子，最后一遍用裂解液洗。
lysate preclear control igG 1 HOUR, 加珠子半小时。
沉淀珠子，抗体和对照igG分别加到lysate中。2小时 ----overnight
加珠子沉淀。
洗珠子3-4次。
loading buffer 煮，100度3min
离心，上样。
包子。 |
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g******t
发帖数: 230 | 42 抗体最重要，对好的抗体， Dynabeads 也就是锦上添花。对某些抗体，Dynal 的
binding 非常弱，结果还不如agarose beads (in my opinion, invitrogen oversold
it)。
不知道你有没有试过mix agarose A and G. |
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L****e
发帖数: 499 | 43 ChIP 有的好做很容易就做出来，有的很难，最关键的是抗体要好。我最近一个用常规
方法怎么都做不出来，后来用了一种 biotin ChIP, 就是将目的基因和一种 biotin
ligase 同时表达，让目的基因biotinated, 然后用streptavadin dynal bead 做ChIP
，这个biotin 最大的好处就是非常特异。你不妨试一试 |
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L****e
发帖数: 499 | 44 ChIP 有的好做很容易就做出来，有的很难，最关键的是抗体要好。我最近一个用常规
方法怎么都做不出来，后来用了一种 biotin ChIP, 就是将目的基因和一种 biotin
ligase 同时表达，让目的基因biotinated, 然后用streptavadin dynal bead 做ChIP
，这个biotin 最大的好处就是非常特异。你不妨试一试 |
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m******5
发帖数: 1383 | 45 Thank you!
I did not go through the reverse crosslinking step for Chip-qPCR
What I did is I washed the dynal-beads by Ip buffer and boiled for 15 mins
in invitrogen LDS protein loading buffer.
recipe |
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q*a
发帖数: 2330 | 46 注：1）版面活动：手续费无；2）个人申请：手续费10%:
奥运版金牌竞猜活动奖励包
代发版面/ID:
Olympics
代发事由(主题标题或链接):
http://www.mitbbs.com/article/Olympics/31832055_3.html
以下ID每人288伪币 (1 ID)
ADSP
以下ID每人158伪币 (2 IDs)
buzhoushan， lxinzhe
以下ID每人50伪币 (5 IDs)
dendron, mir,ridgway,SmileS, painkiller
以下ID每人10个伪币
zli, crabghh, nn2, lin123, franey,
sighfromsoul, mimi123, defire, tosea, cnnssb,
denver, wmxz, mahjong, wsn1900, Acartia, iloveny, oudeshen,
zblgaoxin, swineustc, DoMybest, chehu, Franlindou,
emmac, wgyeric, Iapetus, Gneissee, amy88, z... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 47 "【Military】
TempBM Oct 1 . ●【活动】庆祝国庆吃包子"
截止到611楼 不重复id为593
成功奖励 10 伪币的用户: lsunspot, lovemango, alittlefish, msgc, jayyummy,
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m*********k
发帖数: 10521 | 48 "【Military】
TempBM Nov 15. ● 【军版包子帖】祝贺新一届中央政治局常委今天亮相"
成功奖励 10 伪币的用户: TempBM, lasagne, Diaz, saturnV, reversebell, jocy,
flychina7, conTT, jeanvaljean, zach88, sponge, laohuangniu, GIML, mmxmw,
jayyummy, franklin2, realsun, axolotl, humbledude, VitaminDSD, littleqoo,
shychild, classik, dg22, backpacking, arthir, llsunspot, caoyu, PaiMei,
mihoutaoboy, Fallapart, xzhishya, aptx4689, xinhaodan, etpacino, fcsea,
abcxyz111, whoswhom, finex, linji, Acartia, easylifee, qxdren, greenspring,
gangwei... 阅读全帖 |
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m*********k
发帖数: 10521 | 49 "【Military】
TempBM Nov 15. ● 【军版包子帖】祝贺新一届中央政治局常委今天亮相"
成功奖励 10 伪币的用户: TempBM, lasagne, Diaz, saturnV, reversebell, jocy,
flychina7, conTT, jeanvaljean, zach88, sponge, laohuangniu, GIML, mmxmw,
jayyummy, franklin2, realsun, axolotl, humbledude, VitaminDSD, littleqoo,
shychild, classik, dg22, backpacking, arthir, llsunspot, caoyu, PaiMei,
mihoutaoboy, Fallapart, xzhishya, aptx4689, xinhaodan, etpacino, fcsea,
abcxyz111, whoswhom, finex, linji, Acartia, easylifee, qxdren, greenspring,
gangwei... 阅读全帖 |
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m*********k
发帖数: 10521 | 50 "[Texas]missladybug Jun 27. ● 前250个ID每人发3个包子（到此为止，不再追加
）"
成功奖励 30 伪币的用户: kaoakao, kejieer305, zaosen, Guaguatengte, whuiwhu,
caston, wwww, bihai, HGTVs, cdxt, wufei, ganlanye, juzitang, quickbird,
redalarm19, haku, pballen, flandy, yu1202, ritzcalton, tamandua, matrix8452,
Haoyun2011, halloween, magmar, csthing, xiaodaigua, sanguo, duoduofan, mydg
, Rice2010, VictorIrwin, LANSHEEP, moremj, HEB, anywhere, zuibaxian, qizhu,
jianke, tinybug, jokeyzhu, mdaccbcb, wxx033000, HUAHUATAISUI, nicedayher... 阅读全帖 |
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