m**i
发帖数: 47 | 1 我想把没有biotin的DNA（400bp)从有biotin的DNA（100bp)中分离出来。 之前做small
-scale的时候用的是NEB的streptavidin magnetic bead，效果非常好，而且很方便。
但是现在做large-scale, 感觉太贵了。之后试了pierce的streptavidin cartridge 和
resin, 都没有NEB的分得干净，而且还有20-30%的损失。我不确定是我操作不得法，还
是pierce确实没有NEB好用。
烦请前辈给推荐个好用的产品或者指点一下方法。
不胜感激。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 2 我一直用invitrogen的Dynal beads，不过没比较过别家的，不知道是贵还是便宜。我
觉得不便宜就是了。magnetic beads肯定比普通的beads方便，损失也小一点。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 3 另外，你分离400bp和100bp的DNA，为什么不用胶？虽然没有beads方便，不过便宜太多
了。 |
m**i
发帖数: 47 | 4 多谢多谢。
我也想过用胶。 如果我需要处理10mg的DNA, 怎么能把这么大量的DNA跑上胶然后提出
来呢？我以前只用过kit处理个几ug. |
w******e
发帖数: 1187 | 5 why not recycle the beads afterwards?
small
【在 m**i 的大作中提到】
: 我想把没有biotin的DNA（400bp)从有biotin的DNA（100bp)中分离出来。 之前做small
: -scale的时候用的是NEB的streptavidin magnetic bead，效果非常好，而且很方便。
: 但是现在做large-scale, 感觉太贵了。之后试了pierce的streptavidin cartridge 和
: resin, 都没有NEB的分得干净，而且还有20-30%的损失。我不确定是我操作不得法，还
: 是pierce确实没有NEB好用。
: 烦请前辈给推荐个好用的产品或者指点一下方法。
: 不胜感激。
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m**i
发帖数: 47 | 6
真的可以recycle吗？ 我到从来没有试过。谢谢。
【在 w******e 的大作中提到】
: why not recycle the beads afterwards?
:
: small
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w******e
发帖数: 1187 | 7 I never tried myself either hehe. theoretically, there is a kd involved
(though it's very very low) so you can compete the DNA off. or some
harsh condition (heat, NaOH, etc) may elute the DNA off. don't know
whether you can still use the beads after that thou hehe
【在 m**i 的大作中提到】
:
: 真的可以recycle吗？ 我到从来没有试过。谢谢。
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T**********t
发帖数: 1604 | 8 怎么recycle啊？streptavidin-biotin的binding很紧的，PCR都掉不下来，要洗下来除
非吧streptavidin denature了，可是那样一来不就没法recycle了？ |
T**********t
发帖数: 1604 | 9 10mg，太生猛了，沉淀下来都会是一大坨吧。
不过用大胶，制备胶，多跑几块应该也能搞定吧。。。就是纯粹是个体力活了。 |
w******e
发帖数: 1187 | 10 I agree:) the half-life should be ~10days, so if you add 100X excessive
biotin you might be able to recover your DNA after a month? hehe
but I thought PCR should be good? remember reading somewhere
ppl use heating for elution.
anyway, probably not worth it (though I'm indeed curious:)
【在 T**********t 的大作中提到】
: 怎么recycle啊？streptavidin-biotin的binding很紧的，PCR都掉不下来，要洗下来除
: 非吧streptavidin denature了，可是那样一来不就没法recycle了？
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m**i
发帖数: 47 | 11 我看了NEB家的elution的条件是75C的Tris-HCl （pH 7.5)，也许streptavidin
denature了等凉了之后还能在refold? pierce家的让用Guanidine-HCl,肯定就没法
recycle了。 |
w******e
发帖数: 1187 | 12 I tried gel extraction kit w/ 10ug+ DNA and worked fine.
I tried even higher amount w/ YM columns and got great recovery. they can
be reused too. but don't know whether that's compatible w/
gel extraction buffer
【在 T**********t 的大作中提到】
: 10mg，太生猛了，沉淀下来都会是一大坨吧。
: 不过用大胶，制备胶，多跑几块应该也能搞定吧。。。就是纯粹是个体力活了。
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o**4
发帖数: 35028 | |
T**********t
发帖数: 1604 | 14 对了，这么大量的DNA,跑胶不如跑柱子了。跑个sephadex柱子，400bp和100bp应该很好
分吧，洗下来乙醇沉淀一下。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 15 用heating来elute是要加变性剂比如SDS的，光是加热掉不下来。正常PCR cycling上百
个循环都没事。
【在 w******e 的大作中提到】
: I agree:) the half-life should be ~10days, so if you add 100X excessive
: biotin you might be able to recover your DNA after a month? hehe
: but I thought PCR should be good? remember reading somewhere
: ppl use heating for elution.
: anyway, probably not worth it (though I'm indeed curious:)
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m**i
发帖数: 47 | 16
之前也有想过用柱子，但是怕recover的不好。那10mgDNA我是做了几千个PCR得到的，
感觉超级珍贵。。。不过实在不行，也是值得试的方法。谢谢 :)
【在 T**********t 的大作中提到】
: 对了，这么大量的DNA,跑胶不如跑柱子了。跑个sephadex柱子，400bp和100bp应该很好
: 分吧，洗下来乙醇沉淀一下。
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T**********t
发帖数: 1604 | 17 可以先跑个small scale的看看。我刚才说错了，用sephadex估计分不了，你的样品估
计要用Superdex 200来分，我没跑过DNA的制备柱，但是理论上应该比蛋白难不了多少
吧。
【在 m**i 的大作中提到】
:
: 之前也有想过用柱子，但是怕recover的不好。那10mgDNA我是做了几千个PCR得到的，
: 感觉超级珍贵。。。不过实在不行，也是值得试的方法。谢谢 :)
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m**i
发帖数: 47 | 18 多谢。superdex 200看起来好像能work。到时候不行就试试这个。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 可以先跑个small scale的看看。我刚才说错了，用sephadex估计分不了，你的样品估
: 计要用Superdex 200来分，我没跑过DNA的制备柱，但是理论上应该比蛋白难不了多少
: 吧。
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T**********t
发帖数: 1604 | 19 就是不知道一次上样量能多少。你可以先少上一点，然后慢慢加。反正柱子是反复用的
，绝对renewable。最后就是洗脱体积大一点。用concentrator浓缩一下再乙醇沉淀，
应该recovery也不会太差吧。总的来说比beads便宜，比跑胶方便。
【在 m**i 的大作中提到】
: 多谢。superdex 200看起来好像能work。到时候不行就试试这个。
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m**i
发帖数: 47 | 20 说起这个concentrator, 有没有什么好用的东西呀？我每次都用QIAGEN的Maxi prep去
除蛋白，浓缩 DNA，但是产量从来没有超过60%。 |
