T**********t
发帖数: 1604 | 1 3/5都是什么control啊？你说5是homolog，是你的target protein的homolog么？即使
是近似的蛋白，也不一定在native gel上跑得一样的。还有就是你用DTT处理浓度用了
多少，处理了多长时间？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 2 3是BSA，5是target的homolog——你说的没错未必跑的完全一样。他们MW和PI都
还接近，我就是要show个类似的protein能成band能migrate其实呵呵。
DTT我只做了一次，加了1mM。不知道还要incubate一阵，土了。。。不过整个
准备过程下来，到把probe加到protein里也已经算处理了近1h吧。然后probe
protein interaction也要1hr+ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 3 如果你的蛋白已经aggregate了，加1mM的DTT还原能力不够的。1mM的话，一般只能起防
止二硫键生成的效果。用来打开已经形成的二硫键的话，你加到5mM甚至10mM再试试，
incubate个半小时到一小时的样子再跑胶。
另外，你的蛋白跑SDS胶是纯的么？
还有就是你的蛋白上样量明显太多了，少加一点。
还还有，上回你问的那个Reverse transcription的efficiency的问题，我帮你问过了
，他们都不做测试的，估计反正library够大。。。 |
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l*******k
发帖数: 361 | 4 你试试 0.1%NP40, 这个浓度不会让蛋白变性，但是可以让通过疏水作用结合的蛋白解
聚。另外，你最好radiolabel DNA或者RNA, 3000-5000cts就够用了，这样你用的蛋白
的量会大大降低 （silver staining检测不出来的量） |
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w******e
发帖数: 1187 | 5 非常感谢！
好我再试试
没做这个呢。我以前过分相信厂家了，所有的protein都是买来就用。。。
嗯，我为了找厂家麻烦，特意多load了点，生怕看不到aggregate呵呵
话说我一轮SELEX做下来，最大的感觉就是rp最重要。。。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 6 多谢建议。我试过up to 1% triton，没效果。。。
我就是label的RNA。cts是指scintillation counts？我的远超过这个了。不过我要
测Kd，起码要用a few ug/ml protein，这时library已经跟protein打得火热了。。。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 7 蛋白用着没问题当然就不用专门跑SDS看。但你现在不是troubleshooting么，SDS还是
应该跑一个的，步骤简单，也不需要大量样品。
我非常同意做selex的话rp最重要。。。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 9 try millipore YM columns for buffer exchange+concentration?
specific |
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b**y
发帖数: 86 | 10 Thanks! Which product did you use? |
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a******s
发帖数: 6 | 12 Thanks. I am trying to clarify my question.For most of transcription factors
, there is a specific binding site (consensus sequences) on DNA for them to
bind. Without them, no binding. We can use ChIP or EMSA to test it. However,
for histone, there is no specific binding site on DNA. But histone binds to
any DNA. So we call that the histone-DNA binding is specific, but non-
sequence specific.But for some proteins, they may have some kind of
association, but not direct binding with DNA. So my que... 阅读全帖 |
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t**k
发帖数: 16 | 13 haploview虽然能给出一些risk haplotype, 但是老板让我作功能相关的研究，验证这
些结果，非常挠头，不知道从哪里下手，有人跟我说，针对p值高的分析一些dna 蛋白
结合，EMSA, 但是我感觉很多SNPs都很难说，有点瞎猫碰死耗子的感觉。
老板一心想深入下去，而且还在作进一步的sequencing，并且给我很多比hapmap和
1000genom project 里面更全的genotypes data。 弄得我都不知道怎么利用这些东西
了。 |
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m**z
发帖数: 787 | 15 dialysis不就行了，干吗非要desalting column呢
desalting |
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H*g
发帖数: 2333 | 16 Thanks for all the feedbacks!
Does Dialysis take too much time? I am just too lazy, since desalting column
seems easier. |
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K****a
发帖数: 161 | 17 刚做的，直接透析就行了，4度透析两次，每次1个小时，搞定。 |
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b******e
发帖数: 3348 | 18 对，这就是我想要说的，虽然用的primer是locate在有binding site的DNA上的，但也
不能百分百说明是直接binding,
我觉得也得上emsa才能最后证明，
gel shift没做过是不是很难搞，特别是用什么样的buffer做呢？
binding |
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h**********8
发帖数: 650 | 19 本来实验进展还算顺利，在投文章，老板想起要补一个实验emsa
那就做吧
用p32 label了之后过柱子纯化，被老板娘看到了，于是拉过来blablabla了一番：
老娘我是从专门做分子的牛人组出来的，我们从来不用柱子，我们都是跑胶，再把胶切
碎，再加buffer过夜，然后用乙醇沉淀，然后拿下去测c.p.m, .........我擦，按你这
办法老子得吃多少同位素啊？于是说：我对同位素有心里问题，只想能把实验做出来就
得了，有点单链不影响结果。
老板娘：没事，这个p32可以检测得到，h3才是危险得，因为你吃了h3也检测不到。我
日，这他妈什么逻辑。
还是被逼去做了这么脏得流程。
今天发现信号很弱，结果老板娘把胶从垃圾里拣出来，说: 你这胶切得不细，损失了太
多，得再来一次。。。。。拿下去测了c.p.m再做
我今天明白了，再这么做生物下去，早晚也得这么变态。
生物研究本就是很难的，就业市场上恐怕也是最便宜的，还得糟践自己的身体。
老子实在做不下去了，拿了学位就走人！
生物，我们缘分已尽！ |
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d****h
发帖数: 4291 | 20 直接撂蹶子不干了
当时老板要哥们做emsa，
做了一轮p32，发现吃的同位素比平时做southern多很多（因为标平行探针多）
我就直接找老板谈了，
说反正实验室也没有平台，我自己建平台，那就做飞放
要不我就不做这个实验
后来非放也做得不错的片子 |
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u*********r
发帖数: 1181 | 22 条件摸的还可以， 背景噪音几乎没有很清晰，free probe也很清晰
1.可是在做竞争实验时，加入400x的unlabelled probe （与biotin labelled probe
探针一样） 就是看不出binding complex 减少的迹象， positive control 都 很好。
我用的是 LIGHTSHIFT 试剂盒。
请问是不是 nuclear extract 太多了，过量了，导致足够的factor 剩下后给label 的
probe binding。
2. 形成的binding complex 总是跑不下来，一直就是在最上面， 担心都没有地方做
super shift 了。
谢谢先 |
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u*********r
发帖数: 1181 | 23 刚才考古了本版
发现有人说可能是nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。
我有点不理解，如果在没有nuclear extract 里面没有看到这样的条带，加了过后才看
到特定的条带，这个算是nonspecifec binding吗？ 在反应体系中只有这个labelled
的probe只要能binding 然后显色的不就是specific 的吗？ |
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w********r
发帖数: 1431 | 24 根据你的描述，难道是有东西和biotin结合了？ |
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u*********r
发帖数: 1181 | 25 现在有点confused，所谓的nonspecifec binding 是指什么？
指probe 和非target protein binding？ 那么加进unbabelled 也应该有一定的竞争吧
。因为他们binding机会是一样的对于那个非target protein |
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g*******g
发帖数: 1769 | 26 竞争实验中你是先加入竞争probe还是先加入蛋白？如果是后者，容易理解，有可能是
结合不可逆。 |
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u*********r
发帖数: 1181 | 27 我一般都是先是做一个bind buffer的 master 包含了各种东西想K,Mg，NP40,POLYDiDg
... 然后就是加入竞争probe 再加nuclear extract，在rt先反应10min 最后加
labelled probe。 |
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w*******r
发帖数: 23 | 28 实验室规模不大，多年来一直都在研究一个蛋白，主要技术就是flow cytometry 和
EMSA。
好多关于这个蛋白在其它过程中的新功能都是别的实验室发现的。貌似人家实验室都是
针对一个特定的现象，比如apoptosis，或是一个通路，研究此过程中涉及到的相关蛋
白和调控机制。
在研究中顺带就发现了我们研究的蛋白在这个过程中起的特定作用。
我感觉如果只盯着一个蛋白研究，只能在别人发现的基础上，做做突变，看看不同
domain对功能的影响，再加上我们用的实验技术也比较单一，作出的结果都是很
general的表象，不能在分子水平解释mechanism。 所以很难有什么原创性的发现，发
好文章。
想跟老板说改改方向，针对某个过程研究，估计他不会愿意，因为那样我们就没优势了
。。。他做这个蛋白这么多年了，也很难放得下吧。。。
求板上朋友们指点一二，大牛实验室都是怎么针对一个蛋白研究的？我该怎么跟老板说
呢？ |
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K**********e
发帖数: 188 | 29 不想做同位素，请问那种biotin标记的探针跟同位素相比，灵敏度低很多吗？ |
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z*******o
发帖数: 1794 | 31 biotin容易脏，不过很劲洗结果会比较给力。
感觉上还是同位素灵敏，但从来没有比较过 |
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w******e
发帖数: 1187 | 33 请大家帮忙看看附件：6个sample加了相同量的radiolabeled RNA aptamer，以及
0/2/5/20/50/100 ug/ml 的target protein，RNA MW ~30kD，protein MW ~200kD，PI
~5.3。用的是6% PAGE gel，没调pH。
主要有两大问题：1. free RNA band（bottom bands）是smear，而且band intensity
非常
低。不知是不是因为gel conc.太低的缘故。
2. 如果只是这一点也就罢了，从RNA-protein complex band应该就能得到kD，可是
0protein
smaple就有两条band，杯具。。。
之后做了点troubleshooting: 1. run了其他两个RNA sample，也都有两条band，所以
不是某一
个sample screw up；2. 怀疑protein-RNA complex没有入胶，改用4%gel（以前做过
staining，free protein 4％ gel之下肯定能入胶），结果和附件基本一样。
上来请教一下：1.... 阅读全帖 |
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a****k
发帖数: 1130 | 34 我觉得，你要是把自己的实验过程稍微详细点的描述一下，或者大家会比较容易提建议
PI
intensity |
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I*****y
发帖数: 6402 | 35 RNA probe是怎么做的呀？
PI
intensity |
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w******e
发帖数: 1187 | 36 能不能说说你指哪些过程？incubation吗？gel loading？
我其实不知道有哪些是关键步骤-_-
谢啦！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 37 RNA: in vitro transcription＋phenol＋Urea PAGE purification＋elutrap＋
column desalt。
radiolabeling：artarctic phosphatase，heat inactivate。PNK＋P32 ATP，
heat inactivate。column purify+desalt
thx! |
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T**********t
发帖数: 1604 | 38 看起来像是RNA没跑进胶里的缘故，你的sample buffer和running buffer是什么，会不
会RNA的电荷被中和了跑不动啊？30kD用4%的胶应该肯定能跑进去没问题。
而且为什么你的sample不管是upper band还是bottom band，看起来从左到右都有增加
的趋势？我没做过同位素标记的胶，不知道是不是曝光或者聚焦哪里有不对还是怎么回
事。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 39 sample buffer: PBS+DNA loading buffer; running buffer: TBE.
我平时run cold RNA都是用这个buffer system没出过问题，不过平时用的gel都是
10％ premade gel，room temperature，还是有点不太一样。
upper band有增加我觉得是complex增加的缘故（不考虑极高background的话能fit出
Kd-_-），bottom band确实不应该，我也不知为啥。。。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 40 我们实验室跑native gel用的都是Tris-Glycine buffer，用TBE跑不动，我也不知道原
因，但是TBE就是跑不动。
upper band强度增加是应该的，但是bottom band应该相应减弱才对。因为你每个孔加
的RNA量是一样的，所以上下band的强度加起来应该是恒定的。你每次跑这个胶都会这
样么？ |
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a****k
发帖数: 1130 | 41 30kD的话那你的RNA probe大概有100nt左右了吧？根据我自己的经验，100nt的RNA再加
上个200kD的蛋白，是很难跑进6%的acrylamide gel的，所以要是我的话一般会选择用
agarose gel。还有看起来你的sample是蛋白加的越多band就越强，我怀疑是不是你的
incubation buffer有RNase能degrade你的probe，然后很有可能你的蛋白本身能bind
probe，所以蛋白加多了也就保护了RNA |
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w******e
发帖数: 1187 | 42 bottom band不是每次都强，而是比较random-_-我只run了两三块gel，没发现
bottom band有什么规律。。。
这个还真没想到。。。回头试试看。谢啦！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 43
多谢！我最初的想法是我run free protein都能入胶，加上RNA应该更方便，不过也许
未必。用agarose gel能做radio吗？PAGE毕竟是把胶封在玻璃板里，不用太担心
P32 contaminate gel casette。
我的RNA是2'-F modified，通常没有degradation的问题。
and最后的最后，我还是不明白为啥0protein有upper band。现在只能想到好死不死
用我的system free RNA就不入胶。。。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 44 你做同位素的胶应该有一套dedicated的gel apparatus吧。。。你老板现在有钱，让他
给买！ |
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a****k
发帖数: 1130 | 45 可以做，不过我们一般会单独拿一个casette出来专门run radio的。
如果你一定要用玻璃板，其实我们也试着把agarose配进PAGE里面，不过这样胶会比较
沉，很容易从两层玻璃间漏出去。所以建议用磨砂玻璃板配胶
还有那个size的RNA run 6%的denature gel是肯定不会出现upper band的，所以我在想
或许是有什么secondery structure形成吧，比较你的probe也是经过gel purify的了，
应该不会有别的问题。还是换一个running system吧 |
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w******e
发帖数: 1187 | 46 我们PAGE system是有专做radio的，别人做gel shift都用PAGE没问题，就我比较
衰（当然别人做的都是DNA，挺多步骤不太一样）。
我先试试换buffer成不成吧。多谢啦！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 47 嗯，多谢几位的建议！我要是有好消息回头给大家update一下呵呵。 |
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a********n
发帖数: 844 | 48 BTW，原来lz是标记RNA，我用的是internal labeling，省事多了，一个in vitro
transcription就搞定，不要照搬label DNA 那一套 |
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w******e
发帖数: 1187 | 49 internal labeling是指用比如带biotin的NTP做in vitro xcription吗？
如果是，用哪种NTP呢？麻烦展开说说：） |
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w******e
发帖数: 1187 | 50 又遇到行家了，多谢啊！多问几个问题呵呵
我的RNA都做过PAGE purification，产物方面应该没问题。
你说free CTP我没理解。看你下一个回复，是不是不用radio用的其他方法？
嗯我也听说过这种情况但自己没见过。不知道出现这种情况的时候怎么计算percentage
of bound RNA呢？把所有band加起来作为total？另外，怎么说服别人某个band是
complex band其他都是free RNA呢？
第二次被提醒buffer的问题了。一定要试试。多谢！
真没用过这个。多谢建议。 |
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