a********n
发帖数: 844 | 1 用alpha-CTP，不是gamma-ATP,alpha-UTP也行，不过差点。
RNA in vitro transcription 用Applied biosystems的Maxiscript足矣
biotin没有试过，下来准备试试，可以避免用同位素。 |
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a********n
发帖数: 844 | 2 多条带的情况下如果要做binding curve，建议用filter-binding assay,默认有几个高
蛋白浓度intensity不变，证明所有RNA都结合蛋白被滞留在filter上，所以那个total
RNA,其他浓度下的intensity都除以这个高浓度的。
有个paper里可以见到你碰到的多条带问题，和两种不同的胶和不同的buffer，给你发
邮件。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 3 明白了。好奇问一下，如果xcription时就加radio的话，你们接下来的
phenol/PAGE/elute都在radio room里做吗？感觉确实有点吓人呵呵。
不过这样每个xcript有多个radio label，intensity一定够了：）
遗憾我要用2'-F pyrimidine，只能用epicenture的kit。还是要多谢推荐！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 4 我用filter binding 做过一次了，老板非要用其他方法confirm。。。
and我filter binding做出来的protein bound RNA plateau时只有20％，怀疑是
aptamer有多种conformation，不过也是老板不爽的原因呵呵。
total
非常感谢！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 SPR能confirm就行了。
我是SPR没法confirm结果去做了ITC的。:D |
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d****h
发帖数: 4291 | 7 我曾经做P32持续两年，有的时候差不多每周一次
中国老板，做mapping和做亚克隆做转基因的检测都要求用同位素
转基因都不用PCR初筛的，不管多少样品，一律上southern
更2的是有了Wb结果都还非得要northern
做了两年，现在感觉影响不大，但是心里非常抵触
后来做emsa，因为我坚持要用生物素 |
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t**********8
发帖数: 223 | 8 我覺得可以用EMSA吧？你可以test A alone, B alone, AB, 以及AB加上 cell lysate
等等，看哪個有shift。
如果用SPR，我不知道如果把兩个蛋白都放上去，因為要immoblization，是不是會改變
它們之間native的狀態 |
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c****1
发帖数: 1095 | 9 没有做过，但是可以考虑这个策略：
用已知的这个序列做EMSA（non-radioactive），然后切胶，mass-spec. |
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f********n
发帖数: 6465 | 11 我苦逼作H3的实验，3-4年。每次做实验做到晚上6点，
要放到冰水中放３个小时再去测量DPM。
我每次都是利用这3个小时去，洗米做饭洗菜炒菜洗碗。
我不知道自己都吃下了多少放射性物质，也不知道自己的细胞变异没有。
这种情况，我要到什么样的医院去检查呢？非常担心。
发信人: happylqb2258 (8哥), 信区: Biology
标 题: 我与生物科研缘分已尽
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jan 25 06:15:54 2011, 美东)
本来实验进展还算顺利，在投文章，老板想起要补一个实验emsa
那就做吧
用p32 label了之后过柱子纯化，被老板娘看到了，于是拉过来blablabla了一番：
老娘我是从专门做分子的牛人组出来的，我们从来不用柱子，我们都是跑胶，再把胶切
碎，再加buffer过夜，然后用乙醇沉淀，然后拿下去测c.p.m, .........我擦，按你这
办法老子得吃多少同位素啊？于是说：我对同位素有心里问题，只想能把实验做出来就
得了，有点单链不影响结果。
老板娘：没事，这个p32可以检测得到，h3才是危险得，因为你吃了h3也检测不到。我
日，这... 阅读全帖 |
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f********n
发帖数: 6465 | 12 这个问题，我和老板谈过很多次。
他的说法是，用放射性做便宜。如果用公司的试剂盒，
价格太高了。节约下来的钱，还可以买很多药品的。
发信人: aqua2628 (花幺), 信区: Biology
标 题: Re: 我与生物科研缘分已尽
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 26 00:35:34 2011, 美东)
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=06010701
EMSA 可以不用同位素做
多年前我们就开始用化学发光的试剂盒了 效果一直 很好
不知道你们为啥还要用同位素
发信人: happylqb2258 (8哥), 信区: Biology
标 题: Re: 我与生物科研缘分已尽
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 26 04:37:59 2011, 美东)
哥们，我硕士的时候就是用这个做的
现在老板说贵，还说同位素更敏感，
无语了 |
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c********b
发帖数: 363 | 13 不用担心包涵体,你试试我的protocol (已经发给你了).我的蛋白以前95%都在包涵体
里面,自己摸了这个土方子,那个蛋白可以以native的状态提出来,试了EMSA,没问题.后
来我提别的蛋白都用的这个方法,提出来试过in vitro transcription, kinase assay,
都没有问题.
Good luck. |
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c********b
发帖数: 363 | 14 做EMSA时Kd差不多。有个朋友拿去做kinase substrate,效果不错。别的就没经验了。 |
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g******l
发帖数: 38 | 15 最近做了一个 -ssRNA病毒的nucleoprotein，EMSA的结果发现它和人工合成的一段RNA
没有binding，请问这个结果正常么？
关于病毒nucleoprotein，有好的review或书籍么？
不胜感激! |
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b******y
发帖数: 627 | 16 I agree with the referee. But does the absolute Kd matter in your case or
the relative Kd? For example, you want to demonstrate wt and mutant proteins
have a big difference in binding the same ligand. In either case, to a
reasonable referee, you might be OK if using Kapp instead of Kd in the paper
and also acknowledge your agreement with his/her opinion in the rebuttal
letter. Good luck! |
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d*********e
发帖数: 18 | 17 谢谢回复。
我只是想比较同一蛋白对不同底物的结合能力。Kapp应该可以说明问题。
proteins
paper |
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o**d
发帖数: 3080 | 19 Ikba降解，EMSA，Luciferase etc.
个人不是很喜欢用p－IKB。 |
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o**d
发帖数: 3080 | 20 如果你知道这个蛋白可能结合到DNA上的序列，可以做EMSA。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 22 1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好
抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是... 阅读全帖 |
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i****g
发帖数: 3896 | 23 写得比较有意思，但是不太实用，可能实验条件相差太大。precast gel比自己制的gel
效果要好很多，结果也容易重复。antibody要看运气的，呵呵。
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这... 阅读全帖 |
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u**********d
发帖数: 573 | 24 motif search
组织特异表达数据，上游信号
EMSA排查：探针突变，supershift
luciferase reporter gene assays
ChIP
对照要设好哦。
你确定就是这10bp在干活？ |
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g*******f
发帖数: 427 | 25 其实现在我真的很理解FAQ，因为我自己就遇到类似的事情。
我现在做的课题是接着一个已经毕业的 PhD/MD 学生做的项目研究一个核受体基因的突
变，她的 in vitro 结果表明这个突变对我们研究的目的基因没有影响，in vivo 她死
活就是做不出来，匆匆就毕业了，将她的结果跟合作实验室的临床data 合在一起发表
了，当然没我什么事。
后来我用了一种新的方法表明这个突变是影响目的基因的表达的，ChIP 结果表明这个
核转录因子的突变 binding 到目的基因的 promoter 比 wt 少。这跟她的EMSA 的结果
不符。现在他们 （她和老板）开始改口，说什么这个跟 promoter 的 binding 不是
那么重要，重要的是如何 recruit coactivator 等等，反正就是要维护自己之前的东
西。看他们后面再怎么编故事。其实这还不是什么重大科学发现，就是一平庸的小课题
而已，无所谓什么真假，将故事编圆了，文章发表了，拿到经费了，如此而已 |
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l*****n
发帖数: 24 | 26 马维骏
博士，研究员，博士生导师，教授
药物基因组学研究组组长
研究方向
从基因表达调控角度进行疾病的致病机理和药物防治研究，重点研究疾病发生
和药物作用下表达调控改变的早期应答基因。在生物体主要生理、病理、药理过程的早
期阶段，早期应答基因(ERG)的表达对其发展起关键作用。这些基因的快速表达具有即
早期急性动力学特征。不仅是转录调控，转录后水平调控同样对基因快速、瞬时表达起
重要作用，这是许多即早应答基因(IRG)的特征。大多数即早基因依赖其mRNA非编码区
的顺式作用元件实现转录后水平的调控。为了深入了解其复杂机制，有必要鉴别表达调
控异常的早期应答基因，系统分析验证各种顺式作用RNA调控元件、结合蛋白及其相互
作用。本实验室重点关注免疫应答及癌症发生相关早期应答基因的转录后调控在疾病发
生和药物防治过程中的影响和作用规律，探索它们在疾病诊治和药物研发方面的应用。
主要包括：
1. 免疫应答或癌症发生相关基因非编码区RNA顺式作用元件的鉴别与特性研究；
2. 即早基因在药物应答过程中的转录后水平调控；
3. 受信号转... 阅读全帖 |
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a**********u
发帖数: 28450 | 27 【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
标 题: 问问博后offer选择的问题 （请帮忙转生物版）
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Nov 1 19:47:51 2012, 美东)
目前在美国博后，刚做不到一年，老板要我走人。
现在在同一个学校找博后位置。
说说背景，植物类纯 bench 土鳖博士，没什么文章，混了几个3作之类的，一作只有一
篇还是很小的。没什么技能。只会干PCR 之类的体力活，什么生物信息学数据分析，复
杂牛逼的什么COIP，EMSA 之类的也都没做过。
可能接到的offer 有包括： 1， 植物类刚拿到的AP 实验室，一切刚刚开始， 2， 生
物化学类交叉AP实验室，AP 实验室刚建第二年， 3， FUNGI 类实验室，老板还挺有钱
。 其中1,2 是老中老板， 3 是老美。
目标的话是尽快能发文章，文章大小无所谓。2年之内要回国了。重要是一作，现在博
后都一年了手里还没什么文章，不好找工作啊。
1 的话自己可能稍微熟悉一些，但是刚建立的实验室，老板人怎么样，好不好做都不知... 阅读全帖 |
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H*g
发帖数: 2333 | 28 Need demonstration of nuclear localization, also need in vitro transcription
assay to demonstrate its self-activation of transcription of downstream
genes, besides of your CHIP-seq & EMSA. Any homologs/conserved domains
already demonstrated in other species? |
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d******5
发帖数: 1 | 29 各位xdjm,在下帮国内的亲兄弟问一下（薄厚机会）。 感谢万分。。 近来导师鼓励其
出国深造几年，求各位给指引个方向。
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本人武汉大学口腔医学院博士一名，主攻牙发育，牙髓生物学，今年博三即将毕业。想
在美国找一份博后的位置。
在博士三年期间以第一作者发表了2篇SCI论文（JOE IF：2.8，IVCD： IF：1.3）。另
外有一篇第一作者的文章（JCP IF：3.8）已经修回（小修）。
共同第一作者发表一篇JBC。
有一项专利正在审批。
帮导师撰写过一个自然科学基金面上项目的标书，并申请成功（70W 人刀）。
熟练掌握：细胞培养，基因表达检测（PCR，western，免疫荧光），切片，免疫组化，
原位杂交，一些特殊染色。分子生物学：IP，ChIP，EMSA。转基因小鼠相关：基因型鉴
定，micro CT，骨（矿物）沉积率检测。
现在面临毕业，希望能够进一步提升自己科研水平，希望能在发育学（最好颌面部发育
），或骨科学相关的实验室深造。
谢谢。 |
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f*******d
发帖数: 92 | 30 多谢！ 但是他的下游基因太多了，不知道从哪几个入手，有必要买一个qPCR array 吗？ |
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f*******d
发帖数: 92 | 31 我做了几个时间点，2，4，8 小时的都是大概8－10倍的扩增，24小时之后降到了5倍。
主要是这个assay结果出不来，心里总觉得有什么不对。。。。。不过qPCR是个好主意 |
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f*******d
发帖数: 92 | 32 有人来帮我看看这个序列嘛？会不会是DNA序列不对呢？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 35 如题，月底走人了，当初被老板不以为然的一个课题出了很多data，成就了自己的PhD
thesis。目前的数据整理整理发个oncogene，cancer res应该问题不大（小组，非欧美
学校，勿笑），不过还差个promoter reporter的site mutagenesis 和EMSA的data，这
两个实验做出来应该可以冲一冲hepatology。我觉得这两个实验难度不大，毕竟前面关
键的数据已经做出来了，想带回去接着做完，可是老板坚持要留给自己组里的薄厚接着
做，担心要被share first author，求各位同仁指点该如何应对？
背景：这个课题当初是我在做前一个毫无希望的课题中无意发现的（大家可以搜一下我
几年前发过一个非常绝望的求助帖），PhD第一年结束的时候就给老板讨论过，当时他
不以为然直接否定，到第二年的时候我又出了些data提示有必要尝试一下，老板才半信
半疑的花钱买了2nM的siRNA，连抗体都舍不得买。可喜的是基因敲除实验发现新基因跟
肿瘤细胞的增殖，衰老和侵袭相关，于是我做了一大堆体外功能试验，也检测了在肿瘤
标本里表达，做了expression micr... 阅读全帖 |
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r*******y
发帖数: 48 | 36 1. 两个蛋白都不是transcription factor，但是其中一个有报道可以识别sequence
specific DNA motif by a zinc finger protein。
Do you mean it recognizes DNA motif by a zinc finger domain?
2. 敲除之后，能看到另一个蛋白DNA binding显著增高了。
taken 1&2, it suggests that 1) the other protein is also able to bind DNA, 2
) the presence of the protein mentioned in "1" inhibited the DNA binding of
the other protein.
3. chromatin fraction IP显示两个蛋白是在chromatin上相互作用。
Regular ChIP does not tell you that these proteins interact on chromatin; it
only tells... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 Do you have positive control?
If this is your first time doing this, then you need both positive and
negative controls |
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f*****e
发帖数: 223 | 39 一， 有对照，每次都正确出现，
二， 这套系统用过，另外的两个拿到了结果，shift和supershift。
三， 核抽提物都是一个方法，浓度保持基本稳定，分成小管， -80保藏，每次一个，
没有用纯化蛋白
四， 试过不同盐浓度，没有做梯度，应该试一下，实在不行就放弃了
谢谢
extract |
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f*****e
发帖数: 223 | 41 算了，现在对文章没追求，给别人打工混日子，不愿费那个劲，谢谢。不过，原来用
p32确实一次就出结果了 |
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y*****5
发帖数: 567 | 42 我没用过你的Kit，看起来很麻烦。我就是用SRBY green 染色替代了P32。普通DNA，
加上protein后跑个胶， 拿SRBY green 染30分钟，洗干净，用UVlight 看照相。这样
跑出来的带不如p32的sharp。但是如果有问题你可以看到你的DNA都去哪了。 |
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a****o
发帖数: 1786 | 43 sometimes the concentration of Mg is very important |
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H*g
发帖数: 2333 | 44 我一直在用这个kit, 一直结果还好。 有shift, super-shift以及cold probe
competition。除了glycerol和NP-40, 你还需要调整Mg2+和K+的浓度。你的探针应该是
Biotin-labelled, 能具体说说“探针区域ChIP结果阳性”是什么意思吗？ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 45 能不能in vitro translation合成S-35标记你的蛋白，然后把这个蛋白和你感兴趣的细
胞里分离纯化出来total RNA混合（注意buffer,pH），上Electrophoretic mobility
shift assay（EMSA)gel,比较有RNA和没有RNA的lane上条带的变化。还可以再有一个蛋
白-RNA-RNase的lane作比较。应该可以证明你的蛋白是不是和RNA结合。 |
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r**a
发帖数: 121 | 46 谢谢各位的建议。
目前，我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
我们第一步，只是想证明这个是RNA binding的蛋白
我们目前有一个myc tag的蛋白，在转在果蝇里面（我们是做果蝇的），而且是
functional的，所以可以用这个抗体，但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA （我
不知道能不能尝试，用oligo dT的beads，pulldown，能不能拉下我的蛋白？）
还有一个，我们已经在那个HTH motif做了点突变，有几个突变体有很好的现象，
所以我们还想进一步证明，这个作用是通过这个区域进行的。
所以，只要是一个体外的实验，证明上面两点就可以了。
midwestPhD大哥的方法不错，就是我个人对这个EMSA有点怵（听说挺麻烦的），以前硕
士的时候帮一个师兄一起搞过，没有做出来。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 47 大多数抗体（包括scbt的）染细胞都没问题，但是肿瘤样品基本很难染到阳性（细胞核
），这些样品做EMSA阳性很好。
我对这个领域很熟悉，也没什么好的办法。很奇怪很多文章染的tissue都很漂亮。
background
is
this
! |
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i*********g
发帖数: 1940 | 48 可是我发现只要5端的promoter里有严格的motif,只要有两个或两个以上，一定会有
binding
，做CHIP或EMSA肯定能做出来。 |
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C*********m
发帖数: 213 | 49 我有个蛋白，平时都在核外，某个条件下跑到核内成为（疑似）转录因子。有两个组以
前做过转录活性，但是文章比较老了。我们自己也做过EMSA，看到和DNA的结合，也有
核内核外成像定位的数据。但关键是不能确定是否真的是转录因子。现在的数据也就够
个JBC之流的杂志。和两个实验室试图合作做Chip-Seq，但是对方都不卖力，迄今没有
进展，很失望。请问版上有哪位大哥大姐可以做这方面的实验，短期内能出一些数据，
可以合作写文章。
有兴趣的请私信联系。 |
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j*******u
发帖数: 81 | 50 从来不信EMSA能真解决什么问题
一只都当decorative data看 |
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