w***g
发帖数: 5958 | 1 我已经思而不学则殆了，天天忙着写程序没时间读paper.
：确实。我在历尽好几轮商业循环后，决心要做每天写程序，看文章的业界清流！
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x****u
发帖数: 44466 | 2 目前FLG和普通道琼斯指数公司差异还是很明显的，但从长远看混成传统美国准“国企
”是不可避免的趋势
但你的startup的目标其实也一样 |
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g****t
发帖数: 31659 | 3 都是positive cash flow
: 目前FLG和普通道琼斯指数公司差异还是很明显的，但从长远看混成传统美国准
“国企
: ”是不可避免的趋势
: 但你的startup的目标其实也一样
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g****t
发帖数: 31659 | 4 这个叫独角兽工作。维护有一定难度。
你要被人整不要怪我。一种是你有高层关系cover你。
一种是你卡住现金流，培训一帮兄弟支持你。
(靠掌握一点产品技术小秘密不告诉别人是不可行的，也是不道德的）
前者难持久。后者会有人整你。你要打政治战争。
Python的作者也就混了5年没产出就被赶走了。
Rob pike出来卖艺感觉也是拿钱混饭。
.我不信他和Ken tomposon会觉得认为和无知群众
交流有意思。
: 确实。我在历尽好几轮商业循环后，决心要做每天写程序，看文章的业界清流！
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h**********c
发帖数: 4120 | 6 你说很多后门是不是，人家话没说玩，麦克风就给拿走了。 |
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g*******u
发帖数: 3948 | 8 楼主主要问题是不能全身心投入工作吧？
毕竟也要照顾家庭。 有点心有余力不足吧？
否则去flg或者回国搞个初创公司，成功的可能性还是很大的。
但是这样付出非常多， 5年内小孩老婆都顾不上了。
其实换位思考， 这样未尝不好啊。 人生几十年而已， 够吃的老婆孩子也未尝不是一
个成功。
况且， 且况， 有了这么的积累， 等以后轻松了 没有负担了 说不定会第二春啊 50
岁创业挣大钱 人生巅峰 也未尝不可。 |
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y*j
发帖数: 3139 | 9 现在的DL越来越生产线流水线工业化了，以前的小打小闹越来越不行了。
: 别说是三脚猫开手动档， 就是我这种老司机单枪匹马也没法跟大厂扛。
: 你说的AI云服务，每个后面都有一个团队的老司机，把intern都算进去，
: 平均包裹应该也能超出我两倍了，根本没法对抗的。
: 我也不知道出路在哪里。估计还是得找大厂看不上眼的niche做。或者
: 就是趁大厂的服务还没出来，帮别人先应应急。我的说辞就是，我能做的
: 就是拿现有技术给您跑一跑，最后估计accuracy比当今最牛的差2%的样子，
: 您这生意成不成的了也不取决于这2%，这样您生点钱我省点力，等生意真
: 的做起来咱在花力气提高，说不定到时候还能免费获得别人更新的研究成
果。
: vision
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k****i
发帖数: 101 | 10 术业专工，数据收集分析处理学习，看文章理思路写程序，容器化云端化自动化，留个
ｓｏｃｋｅｔ，前端界面外包，Ａｎｄｒｏｉｄ，ｉＯＳ，ｗｅｂ，ｗｉｎ，ｃｌｉ，
爱咋的咋的，再找上商业伙伴落地。 |
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n*********t
发帖数: 64 | 11 要正规就用flask, 或virtualdub |
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c*****h
发帖数: 8 | 12 先期准备工作
由于制作DVDrip的流程较为复杂，需要用到的工具软件也较多，因此事先应该做好准
备工作，以免正式开工时手忙脚乱。
1、电脑硬件及工具软件的准备
制作DVDrip需要的工具软件：
文件拷贝软件——SmartRipper
计算视频流码率软件——Advanced DivX Bitrate Calc！
视频部分制作软件——FlasK MPEG或Xmpeg
音频分离及制作软件——DVD2AVI
最终合成软件——NanDUB
字幕制作软件——VobSub
2、复制VOB文件至硬盘
从DVD盘片中复制.vob文件至硬盘，是最为关键的准备工作，复制质量的好坏将直接
影响到最终输出的DVDrip效果。
打开DVD根目录，可以看到这里面有两个子目录：AUDIO_TS与VIDEO_TS。AUDIO_TS中
没有任何内容，DVD的所有信息都存放在VIDEO_TS目录中。这个目录包含了.vob、.ifo和.
bup等三种类型的文件。
其中VOB文件用来保存MPEG-2格式的影音数据，这些数据不仅包含影片本身内容，还
包含了菜单和按钮等画面，以及多种字幕的子画面流。而IFO则用于控制VOB文件的播 |
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p*****n
发帖数: 981 | 13 ☆─────────────────────────────────────☆
giantbird05 (大鸟) 于 (Thu Jan 25 20:19:46 2007) 提到:
要裂解几十个T75 FLASK的细胞，然后用抗体把裂解液中的蛋白拉下来。。
裂解液的要几十毫升，我想浓缩一下，但是怕变性影响以后的免疫沉淀。
高手请进，帮我指导一下。
多谢了。
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pigskin (六如) 于 (Thu Jan 25 20:23:50 2007) 提到:
裂解液中的蛋白浓度已经很高了。。。
不好浓缩，而且容易把目标蛋白搞死。
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KingofMS (offer来了，H-1B没了。我苦) 于 (Thu Jan 25 20:24:05 2007) 提到:
columns packed with C4 (based on hydrophobicity)?
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d****i
发帖数: 360 | 14 Hi, I am going to grow some cells in a suspension form since they can not be
attached to the flask bottom. I am wondering in this case how I can change
the medium since the cells are in the medium. Thanks! |
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p******d
发帖数: 3737 | 15 实验要用siRNA 瞬时knockdown贴壁细胞系老鼠的Notch1和Notch4。有没有人推荐哪个
公司的哪个
产品效率比较好的？
我初步看了一下ambion的产品，不知道买多少比较合适？怎么稀释？有没有前辈有转染
的protocol可
以参考一下。我打算是要做T25的小flask，因为要比较多的细胞跑流式的。 |
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x*****a
发帖数: 972 | 16 我从血液中提取了一些progenitor cells，在flasks上养了几天后，冻成好几个vial。
这两周，
化了3个，分别做了flow，看其中CD105+的比例，结果3个vial的比例分别是55%，30%，
12%左右，
差别很大。
这种情况，算正常的么？
每次的操作都一样。 |
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r******c
发帖数: 98 | 17 我当时就是放在fedex 那种扁盒子里，塞满foam,防止flask被压。当作一般物品寄到的。 |
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S**V
发帖数: 405 | 18 求教版上各位老大：
近期（1-2月内）想带一个细胞系(mammalian)回国。请问该怎么操作？
听说有人直接把flask绑在身上。这样安全么？在机场会不会被抓到？有别的方法么？
邮寄回去是不是非常麻烦？
多谢多谢！ |
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S**V
发帖数: 405 | 19 你是说带身上？
那需要贴壁的细胞不能贴壁怎么办？
我以前知道有人把flask绑在身上带回去的 |
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C*****h
发帖数: 926 | 21 1. Seed 1.5x106 293T cells per 10 cm plate in 10 ml growth media (
DMEM + 10% FBS). Usually, one T-175 flask of 293T cells at 90-95% confluency
is split to 12 plates (10-cm).
2. Incubate cells for 24 hours (37 °C, 5% CO2), or until the cells reach 40
-50% confluency (no more than 70%).
3. One hour before transfection, replace old growth media with 9 ml fresh
growth media (DMEM + 10% FBS).
a. Prepare plasmid mixture at 23 °C:
430 ul H2O
20 ul plasmid (1 ug/ul)
50 ul CaCl2 (2.5... 阅读全帖 |
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f****s
发帖数: 133 | 22 我觉得还是留在牛老板实验室好，钱，我是说科研经费和奖学金通常比较有保证
想我呆在AP的实验室，本来项目进展还比较顺利，结果现在老板的R01很可能renew不上
，现在买个shRNA都付担不起了，本来要用的细胞系也买不起了只能管认识的人要别人
也是爱答不理的，更不用提本来我proposal里写的动物模型了，提RNA以前是kit现在是
trizol，做qPCR以前用supermix现在都自己配还用中国产的taq误差很大有时做几次就
有几次完全不同的结果，几乎所有的buffer都是自己配的出问题都不知道怎么
troubleshooting哪个环节都可能会出错，现在枪头都是自己买大包自己装盒子里用，
养细胞的大flask还得涮涮重复使用，一周一半的时间在准备这些玩意儿，下个学期还
要去做TA能做实验的时间就更少了，CHIP我都是自己设计N多个引物看能不能碰运气扩
出来，旁边的实验室的哥们做类似的项目都用上CHIP-seq了，结果好省时间还学到新技
术，每次committee member见面问我进展我都不知道怎么说了
还犹豫啥呢，楼主？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 23 As you folks are discussing Cori, I happened to read his autobiography and
find it both interesting and enlightening:)))...BTW, it sounds Richard Axel
is a lot nicer than what I/we have heard...or in another word, his cruelty
is rooted in his obsession with science and indifference to humanity:))); As
well, it is pretty...he noted Cori but left his ex out...pretty human or
not human?
Autobiography
Richard AxelNew York City is my world. I was born in Brooklyn, the first
child of immigrant parents... 阅读全帖 |
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A******d
发帖数: 571 | 24 I am working with a mouse liver cell line (Hepa1-6) from ATCC. There are
always clumps of cells in the flask here and there. I tried pipeting up and
down- didn't work. I even vortexed the cell suspension- cells are still
clumped.Anyone has experience of breaking up clumped cells? Thanks! |
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c******r
发帖数: 90 | 25 就是养E.Coli的flask上隔菌透气的封口膜，如附件所示（当然也可以是圆边的）。这
个膜可以经受121度灭菌，可以反复使用。哪位ID能给点儿详细信息？
急用，非常非常感谢！ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 三次方成反比啊？
我一直以为是二次方
我很同意，这样的实验室极端不规范
有很多安全隐患
还是跟做实验的人有关吧
但至于是不是出奴隶
我觉得到不一定
只能说实验室的人有点粗线条
如果去公司或者研究所
就会管理很严了
有时候甚至是一种负担
比如说我现在呆的地方
居然连液氮都不给我们用
然后弄个二氧化碳的罐子
还要评估半天，看如果最坏情况下整个罐子瞬时漏光，会不会有人缺氧死掉。。。
然后想设个发酵罐或者flask里通管子进2-5%二氧化碳的，连续鼓气的那种
我们什么东西都买好了
最后管safety的研究了半天（事实上是一两个月）
最后结论是我们不能这么养，有安全隐患
只好买带CO2的光培养箱，加上超级昂贵的CO2 regulator（几个要两三千）
不能用gas flow meter
然后培养箱里放摇床。。。。。 |
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m*****y
发帖数: 857 | 27 no. at least you need a vial or a flask |
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s*****g
发帖数: 7857 | 28 波兰妹妹带细胞往返是在灌满medium的flask里.质粒就放在冰壶里(不是干冰). |
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x*****a
发帖数: 972 | 29 这个从engineering上说，毫无难度，分分钟都能做，就看你愿不愿意花钱，以及flask
厂商们愿不愿意投产了。
就是做ELISA，现在也可以用microfluidic来做，效率比人做的高多了；就是
microfluidic chip也不便宜就是了。便宜的ELISA chip是纸做的，但是精确度又下去
了。 |
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d***8
发帖数: 2039 | 31 让flask坐冰上两小时，然后用iced PBS吹。
操，我怎么把这秘籍给漏出来了。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 32 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题 |
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g***y
发帖数: 201 | 33 我拍了很多图片发给他们了，貌似他们在调查。在这里提醒大家ATCC的细胞也不是那么
可靠的。
“The Specialist has authorized a growing flask。。。。 This will allow us
to start another culture from a frozen vial and observe it for visual
contamination. ” |
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i***l
发帖数: 1656 | 34 determine pH of your 1 liter LB
spin down 10ml ecoli, resuspend with fresh media before transfer
lack of O2? there is special flask for large scale biomass culture
colony contaminated and outgrown in the 10ml tube?
growing |
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e******e
发帖数: 2 | 35 谢谢。请给一个买special flask的 link. |
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m******n
发帖数: 121 | 37 我们是用polyheme coat flask养sphere，然后就不怎么贴壁了。虽然我一直不知道具
体机制。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 38 我的细胞复苏后怎么不beat?
难道是因为flask没有coating?
请高人指点 |
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m******5
发帖数: 1383 | 39 BTW, I think LZ should start from coating the flask |
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g*********5
发帖数: 2533 | 40 yes.
and use fibronectin flask. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 41 I would use gelatine to coat the flask. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 42 can I reuse the gelatin/fibronectin solution to coat other flasks?
thanks. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 43 注意media Lot的原产国
最重要的一个 可能是
去甲肾上腺素
1% norepinephrine (Sigma-
Aldrich, Germany)
from
北美的有的牛来源的原料
其中的疯牛病因子 and 瘦肉精因子等比德国的EU标准高
以下的所有东西 订货 按原产国来 订货 then try again.
Cell culture
>The HL-1 cardiomyocytes (murine atrial tumor cell line) were
maintained in monolayer culture with Claycomb-medium (Sigma,
Germany), supplemented with 10% fetal calf serum (SAFCBiosciences,
USA), 1% penicillin/streptomycin, 1% glutamax
(both Invitrogen, Germany) and 1% norepinephrine (Sigma-
Aldrich, Germany) in an incubato... 阅读全帖 |
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f******s
发帖数: 440 | 44 搜搜Celline bioreactor, 高浓度细胞培养
给lab scale用的
如果不够的话，养10L不常养就用shaker flask或者spinner bottle. 买个wavebag
system 就用一次是吃饱了撑的
到了10L要考虑过滤细胞，titer多高，跑多大柱子还是batch, 有没有FPLC...如果能提
高titer会事半功倍，试试不同cell line, 培养液...
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.3 |
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o*****d
发帖数: 11 | 45 10L左右的话，GE wave system比较方便，主要是整个cellbag是disposible的
也可以用stirred bioreactor
你可以做10x的scale up。比如 1L 到10L
CHO-S（invitrogen）的话比较皮实，1E5/mL都没太大问题
293F (invitrogen)starting conc. 3-5E5/mL
media的话，如果你不要求高密度，DMEM/F12, rpmi都可以
如果加血清的话更好
很多公司都卖serum free medium
拿CHO-S 做例子，有invitrogen, hyclone, irvineSci等等
wave cellbag不用灭菌，传统的glass flask用蒸汽就可以了
inoculation的话 上youtube看看教程吧
你们表达啥蛋白啊？ outsource是最好的选择了吧
又快又省心 |
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d**l
发帖数: 1546 | 46 你打算怎么带啊？
托运还是随身？ flask还是冷冻？ |
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d**l
发帖数: 1546 | 47 你打算怎么带啊？
托运还是随身？ flask还是冷冻？ |
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y********g
发帖数: 782 | 48 Treat的细胞也是这样子的，好像细胞“漏”了似的~~~
细胞悬浮了会是这样子的吗？悬浮细胞一般都是圆的吧，我的看起来好像还贴壁。
用同一个incubator的女生的细胞没有问题，我Flask里面传代的细胞也没有问题。哎，
纠结死了。。 |
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