p***i
发帖数: 96 | 1 我用的是CAMKII Cre 老鼠与我的flox老鼠杂交，希望只在forbrain区knockdown我的
gene. 目前得到了Cre Hetero/flox hetero还有Cre homo/flox hetero.
请问如何检测knock down efficiency呢？
1. take forbrain, extract genome, RT PCR
2. perfuse brain, immunostain brain sections with antibody against my gene
of interest. Can I costain with anti Cre antibody? If so, where can I buy a
good one?
3. DAB staining brain sections using antibody against my gene of interest.
请问一般Cre 的knock down efficiency 是多高？ Cre homo or hetero 会有很大区别
吗？
谢谢 |
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l****i
发帖数: 20439 | 2 一般不搞cre homo的。一个cre就足够了
efficiency要用cre;flox/flox的老鼠做
a |
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h*****n
发帖数: 2023 | 3 you should compare Cre Hetero/flox homo and wt/flox homo
do not use Cre homo. |
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m******n
发帖数: 121 | 4
也就是说最后得到的老鼠里面是纯合的flox／flox+杂合的cre+／-？ |
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s******r
发帖数: 1245 | 5 不知道你的TAG指的是stop codon还是peptide tag
不管放啥，都是在做floxed 的allele的时候设计好一块弄进去，跟cre那步没关系，
cre只负责去掉floxed region
没弄过的自己实验室找个老手带着弄，否则就花钱找公司找facility做，能做这种外包
的大把，自己瞎琢磨浪费时间不值当 |
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m******n
发帖数: 121 | 6 这个cre老鼠是别人自己做的有特异promoter的那种。。另外杂合的交一次得到的flox
也是杂合的，还得再自交。。。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 7 特异promoter和定点插入是两个概念啊
flox |
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j*******8
发帖数: 933 | 8 老板让tag体内一个蛋白， 想从细胞做起， 然后造动物。请教一下大神们： 有没有可
能把FLOXed gene 用简便快速的方法再加一个TAG？ 比如用cre 带个tag进去， 剪切同
时插入一个tag? 俺不是学分子的， 望大家不吝赐教！ 感谢感谢！ |
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l******n
发帖数: 298 | 9 楼上说得对啊，都是插在flox中间或后面，也可以同时插。牛逼的差法可以参考
richard lee nature med的aging文章。他好像插了至少两个。 |
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S**********e
发帖数: 620 | 10 cre就好比一条听话的狗，只咬一个带有flox标记的骨头，你放一百只狗进去，他们不
得乱咬。再听话也是狗啊，吃骨头的。 |
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w***j
发帖数: 88 | 11 前辈们指教一下：
我有一个A flox/flox 的mice，需要和Tek-Cre杂交，得到血液系统敲除的A -/- mice。
Breeding程序如下：
1. A flox/flox mating with Tek+ 得到 "A wt/lox Tek+" and "A wt/lox Tek-"
2. "A flox/flox" mating with "A wt/flox Tek+" 得到以下四种：
"Rictor wt/flox Tek+"
"Rictor flox/flox Tek+"
"Rictor flox/flox Tek-"
"Rictor flox/wt Tek-"
"Rictor flox/flox Tek+"是我要的KO, 称为Hem_A -/-, 那么"Rictor flox/flox Tek-
"是我的对照,称为Hem_A +/+，是不是这样？
做实验是不是最好还要wild-type？ 那么wild-type是哪个？
叩谢！ |
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w***j
发帖数: 88 | 12 小弟课题中的一个cKO mice 最近一直在育种
假设基因是A
目前用A flox/flox 和 A flox/wt;MX1-Cre杂交，且已经获得了A flox/flox;Mx1-Cre
那么，现在最好的方法是不是拿A flox/flox;Mx1-Cre mice和A flox/flox杂交？
这样下来的小鼠一半是A flox/flox;Mx1-Cre mice，另外一半是A flox/flox，后者正
好是对照 |
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b*********g
发帖数: 65 | 13 因为老鼠数量现在不够，所以想用female A-Cre和male B flox/flox (A表示一种cre，
B表示要研究的gene) 来generate A-Cre+;B flox/flox的老鼠。
但是被告之，最好用male A-Cre和female B flox/flox这样的方式来交配，不然的话会
被flox site给delete掉，变成global deletion。
有谁能帮我解释一下原因吗？谢谢 |
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D*a
发帖数: 6830 | 14 另外刚跟老板讨论这个问题，如果用cre /cre，cre倒是有control了，可是loxp位点没
有control了，也许你加进去的loxp位点somehow影响基因表达呢？所以我们组用的wt
mice实际上是flox/flox, 作图的时候写"control"，不写"wt"
也有人为了这个会多加一个纯粹的wt/wt作为control group, 用来跟flox/flox比较证
明flox/flox是wt的表型。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 15 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2/APC(flox/flox)
GeneX(flox/flox)
GeneY(flox/flox)
三组老鼠都是C57BL/6J background, available at jackson lab
拿来cross，希望两年之内拿到Lgr5-EGFP-IRES-creERT2/APC(f/f)/GeneX(flf)/GeneY(
f/f)老鼠
版上的老鼠大牛们指点指点，breeding的过程中可能出现啥倒霉情况，能让整个
project彻底泡汤，谢拉 |
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S******9
发帖数: 2837 | 16 根据你的描述，推测你的mox2-cre是一个non-inducible的Cre老鼠。你已经建立了 A
flox/+：Mox2-Cre的老鼠line。这个只有小于或等于50%的A基因的deletion， 因为你
只有一个
alle上的A的剔除。
我们一般是做A flox/flox： Mox2-Cre。这样就是2个alle上的A都剔除了。
一般的文献是用Mox2-Cre做control老鼠，用A flox/flox： Mox2-Cre 或者A flox/+：
Mox2-Cre做study group。 |
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c********o
发帖数: 135 | 17 即使是一个copy的Cre转基因也应该有control。记得nature发过一篇关于Cre的
toxicity的paper，大致是因为很多转基因的Cre都是很强的promoter驱动的，会影响插
入位点附近的基因表达。所以floxed/floxed并不是floxed/floxed;Cre的最好control
，应该是floxed/wt,Cre。
现在有一些cre是knockin在promoter下游的，至少位置是清楚的。另外一个办法是
knockin在Rosa26的位置。
Homo Cre有phenotype是挺有意思的，原来隔壁实验室就有过，但花了很多时间想搞清
楚插入位点，但最后是不了了之了。 |
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s******n
发帖数: 47 | 18 原则上Cre;flox/flox X flox/flox 是可以的。
但是最好还是要加一个 Cre;flox/+的做对照，否则无法排除Cre本身的影响 （Cre本身
的表达，以及Cre-tg的遗传背景影响） |
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h********n
发帖数: 4079 | 19 那你到了最后的选老鼠岂不是比例很低? 是不是要很多老鼠来选?
我的有些类似, 一个oncogene, 两个Flox/Flox, 一个Cre老鼠. 其中两个flox/flox我
都要homozygous.
谢谢. |
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g****e
发帖数: 137 | 20 I need homozygous for 2 flox/flox, heterzygous for one flox/flox and cre, it
took me one whole year to get it. The ratio at beginning is very low, but
you can increase efficiency after a few rounds of mating. |
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D*a
发帖数: 6830 | 21 我们只用A flox/flox ; Cre 和 A flox flox交配，一半cre+,另一半对照 |
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w***j
发帖数: 88 | 22 Dua说的是最简洁的一种，最后的就是A flox/flox;Cre和A flox/flox，后者是对照组
，但这种做法完全不考虑Cre的影响。
htscorpion的方法比较复杂，还要同A wt/wt;Cre作对照，可能更为严格一些，但也更
为复杂。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 23 很赞同新AP期间不以老鼠主打，老鼠确实很难快速发文章
但是建议早着手，把你自己的生化等实验撑起来之后就开始分一点时间给老鼠。
我们这里的情况，引进一个现成的cre老鼠，从对方实验室同意算起，到引进到local的
facility，各种行政手续要半年以上 ，大部分是等的时间，还有的时候对方的老鼠是
冷冻胚胎什么的，这就又要等复活老鼠。然后再跟一个现成的flox 交配，还要2代才交
成flox/flox，这又是半年。
然后一堆preliminary的“没用”data也很费时间
如果你想自己做flox的话，那就更费时间了，还不知道能不能成功
所以开头做老鼠的两三年如果没有其他事情做，简历上就是一个大gap。
ps，怎么可以看出来谁在recruit committee里面的？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 24 很赞同新AP期间不以老鼠主打，老鼠确实很难快速发文章
但是建议早着手，把你自己的生化等实验撑起来之后就开始分一点时间给老鼠。
我们这里的情况，引进一个现成的cre老鼠，从对方实验室同意算起，到引进到local的
facility，各种行政手续要半年以上 ，大部分是等的时间，还有的时候对方的老鼠是
冷冻胚胎什么的，这就又要等复活老鼠。然后再跟一个现成的flox 交配，还要2代才交
成flox/flox，这又是半年。
然后一堆preliminary的“没用”data也很费时间
如果你想自己做flox的话，那就更费时间了，还不知道能不能成功
所以开头做老鼠的两三年如果没有其他事情做，简历上就是一个大gap。
ps，怎么可以看出来谁在recruit committee里面的？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 25 qPCR mouse tail tissue extraction DNA
pls refer,
>The SM22aCre-ERT2 mice (Kuhbandner et al. 2000) were generously provided by
Robert
Feil (Interfakulta¨res Institut fu¨rBiochemie,Universita¨tTu¨bingen,
Germany). SM22a protein binds actin and contributes to
smooth muscle contractility ( Je and Sohn 2007; Assinder
et al. 2009) and is expressed specifically in adult smooth
muscle cells of the vasculature and viscera. Genotyping
primers used are listed in supporting information,Table S1.
Genotyping ... 阅读全帖 |
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t******k
发帖数: 5617 | 26 Compare mice group A and B after tamoxifen treatment:
Group A genotype: tamoxifen-Cre+ Flox/flox
Group B genotype: flox/flox |
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a******s
发帖数: 37 | 27 用flox/wt;cre好 还是flox/flox好? 需要再加一组WT congenic吗？ |
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h********n
发帖数: 4079 | 28 我觉得最终的比较组:
Rictor wt/flox Tek+
Rictor flox/flox Tek+
Rictor wt/wt Tek+ |
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D*a
发帖数: 6830 | 29 fl/+ 和 fl/fl的比例应该是没什么疑问，因为你这一步只是剪尾巴看体细胞。但是现
在你对oocyte敲除有疑问，让被敲除掉的卵子受精看看是不是能长成-/-，我觉得这个
应该比pool卵子更有效一些。
如果你用收获的卵细胞来做PCR或者RT PCR，如果混有别的细胞，会有污染，到时候你
也不知道是因为体细胞污染，还是因为你的卵细胞敲除不完全。
如果这个蛋白敲除不影响卵子受精和胚胎发育，-/-的老鼠我觉得是最有说服力的。
genytype的问题毕竟还是用genotype最有说服力。这是我能想到的方法了，不知道其他
人都是怎么做的。
PS我突然想到卵细胞是单倍体啊，按你写的母鼠genoytpe，你的Cre应该只能进一半的
细胞里啊，所以你的卵细胞不是应该只有一半是KO的？还是Cre相当多没有allele的卵
子里面也会有Cre蛋白？反而你的细胞里都是flox单倍体，没有两个等位基因需要敲除
啊，跟两个flox还是一个flox的效率没关系啊。 |
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F**i
发帖数: 43 | 30 我觉得会让GFP表达，我曾经电转creERT2和flox-stop-flox－GFP质粒，结果还没打
tamoxifen老鼠的细胞已经绿了。说明有leaky。
flox |
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t******k
发帖数: 599 | 31 主要是最近想做个体外实验，利用cre-flox来标记细胞。一个方法是把floxed的质粒转
到本身有promoter-creert2的细胞里，另外一个方法是把cre质粒转到本身带有floxed-
reporter的细胞里面去，再有就是把两种质粒一起转到wt细胞里。然后就想到这个有
promoter-creert2的细胞不加tamoxifen是不是也可以起作用了。 |
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D**F
发帖数: 54 | 32 最近用PCR鉴定 loxp小鼠
在flox区域两侧设计引物， 理论上WT 产物较短，floxed产物较长
但奇怪的是，要么只看到长的产物，要么只看到短的产物，从来没有见到过同时有长短
两条带
根据交配后代的结果显然那些只看到 长产物的小鼠中是有 loxp +/- 杂合体的
有人遇到过这种情况吗？
感觉是floxed allele在PCR中抑制了WT的扩增
但为什么会造成这种抑制实在想不明白 |
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H****N
发帖数: 997 | 33 You point regarding cre transgene and the floxed gene to be knocked out on
the same chromosome is interesting. This can be a problem in practice.
People don't always map the transgene. However, if you have a hard time
getting the flox/flox;cre mouse, it is likely due to that the transgene and
the gene of interest are closely located on the same chromosome.Of course,
you still need to rule out embryonic lethality first.
same
routine
kinds |
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g****e
发帖数: 137 | 34 I did so, with 3 different flox/flox and one cre mice |
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h********n
发帖数: 4079 | 35 A-flox/wt X A-flox/wt Cre/Cre 就可以得到三种.
我觉得, 选什么样的对照, 要看你的目的是什么. |
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s******r
发帖数: 2876 | 36 以前没养过老鼠，现在开始学，
老鼠都是Jackson Lab的，Trangenic 或者 Knock-out，Knock-in，
我有一些很基本的问题想请教大家，
1，通常大家怎么标记老鼠，打耳洞，剪指甲？哪一种比较方便能够
追踪每一只老鼠？
2，大家应该用软件管理老鼠吧，一般那种软件比较常用？每只老鼠需要记录那些信息？
3，自己实验室养老鼠，大家还严格纪录代数吗？比如F1, F2, ....Fn等，F应该是兄妹
自交吧？如果回交的话，比如F3和F1杂交，那代数怎么算？还有如果两种Trangenic老鼠
杂交，比如Cre line跟flox line杂交，最终拿到flox homozygous的老鼠，这一般至少
两代，这每一代该怎么记录，这肯定不能算是F了。
请大家多指教。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 你想敲掉的基因的exon 两端先knockin flox element
然后和已经knockin 由某个特异pomoter 驱动的cre基因的老鼠杂交
杂交后代的老鼠，在某些组织里会表达cre蛋白，就把flox element 镶嵌的基因序列
剪掉了。 |
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s******a
发帖数: 134 | 38 Could anyone please help me with some conditional KO questions?
Our lab have flox-transcription factor X-flox mice. I am thinking of
crossing these mice with some kind of
cre mice for conditional knockout of X . My purpose is to study the down
stream target of X. Specifically, I plan
to culture the cells in vitro , induce deletion of gene A in vitro, and to
examine gene expression between WT
and X KO cells. My questions are :
1) I hear that the efficiency of inducing conditional KO in vitro... 阅读全帖 |
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i*********0
发帖数: 915 | 39 我做的gene (A)在胚胎早期deletion导致lethal phenotype,我想看看在胚胎发育中期
或者晚期 (从15.5开始)deletion, A
gene 对发育的影响. 我的一个line的老鼠是A gene flox/flox, ER-cre+ 的,我想用
OHT 或者4-OHT 在E15.5的时候诱导
A gene deletion, 目前考虑两种方法:一是做ip注射好,二是是通过drinking water.
我只看过一些在成体做Ip 的paper,但是
用的volume都比较大,我也不想给怀孕老鼠更多的stress. drinking water倒是没有伤
害,但是我担心deletion的效率不高.
不知道那位有更好的办法,或者comment一下我列举的.
谢谢! |
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D*a
发帖数: 6830 | 40 f/-是说flox/-? heterozygote？
其实我也不知道他的cre是怎么回事。。。
这个cre在老鼠里面不表达的么？表达的话不就是现成的conditional KO
anyway，既然有flox的老鼠，弄个+/- 还是挺容易的
有MeuCre40和EIIaCre，都可以造成杂合体胚胎，再交一代就是+/-了
不过现在conditional KO才是王道吧，+/-好像都没人玩了
好多cre也都商业化了吧 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 41 flox跟+/-杂交就可以产生flox/-,这样cre只需要delete一个allele.另外野生型老鼠都不表达Cre的. |
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D*****l
发帖数: 554 | 42 谢谢您的建议！由于没有玩过knockdown,我想做下面的实验：
分离MEF (Flox/Flox) + adeno virus expressing Cre (or control). 来检测p53表达
量，
再看看 细胞衰老的变化。MEF只能长4--5代，或许我的宝贝基因干掉之后，细胞长的更
快，寿命更长。
test |
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D*a
发帖数: 6830 | 43 俺们实验室一个promoter-cre和同一个flox基因的project，文章跳了个热坑发了以后
（非CNS），看见另一个实验室做的同一个promoter-cre和同一个flox基因的文章，但
是promoter-cre的老鼠系不一样，他们那个表型太强，老鼠生下来几天就死的差不多了
、、、 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 >: flox啥的你要是不知道自己查查吧。
Just go to
//en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_recombination
//en.wikipedia.org/wiki/Floxed
ps:
又学了一招 Merci Dua.
program |
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z****u
发帖数: 1007 | 45 推荐JAX的 ZsGreen flox 和 TdTomato flox. Allen Institute的Hongkui Zeng建的。
都是非常好的fluorescent reporter. 能直接看到荧光。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 46 我的意思是楼主不用担心loxp丢掉，至于能不能用是另外一回事
一听到自己不用做老鼠的就妒忌得不行……做construct打ES再等germline
transmission 最后等表达等phenotype多折腾人啊！！！
设计那么多酶切位点太夸张了，我觉得只要PCR sequence一下就可以了
800 bp那个floxed region他们设计酶切位点是precautions?最后有发现只有一个loxp
的克隆么？我看文献里报道了这种情况的都是2k floxed region才发生的。 如果800
bp能发生岂不是说明short arm只要800bp就能做targeting? (当然也可能，不过300bp
我觉得如果发生了可以发个genesis报告了)
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mo100159.
鼠女王能帮忙下载一个paper么？ |
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r*******y
发帖数: 48 | 47 1. floxed 300 bp should not present any problem for recombination;
2. introducing a disgestion site is a good and reasonable design for future
southern verification, if there is no endogenous restriction site(s)
available for southern strategy;
3. you should pay more attention to the design of the arm length. Based on
my experience, over 5000bp/arm is recommended; shorter than this will reduce
the specific recombination efficiency, although some reports also suggested
that a shorter arm also wor... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 恩 最佳是捞现成的flox的老鼠跟不同的cre和疾病gene交 省了十年工夫 哈
LZ
if you want to know more about this topic,
pls refer one old post:
同主题阅读：Re: 据说做果蝇和线虫的都是相亲相爱大家庭，有人现身说法一下
[版面:生物学][首篇作者：Dua] , 2012年08月23日
that post reply:
发信人: Oncogene (何时问天), 信区: Biology
标 题: Re: 据说做果蝇和线虫的都是相亲相爱大家庭，有人现身说法一下
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Aug 24 11:37:30 2012, 美东)
其实还有一个很重要的原因，就是以前很多实验室一个老鼠就可以维持好多人好多年
的科研，所以别人来要，总是要担心自己的生计。很正常。
现在做knockout transgenic knockin啥的越来越容易，而且JAX也在努力收集散养在
各个实验室的老鼠系，IKMC正在试图做遍所有基因的KO，所以这个问题会慢慢得到解决。
=======
发信人: Dua... 阅读全帖 |
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j****z
发帖数: 67 | 49 我有一个基因A-flox的line,我用mox2-cre的line,把它做了一个germline deletion,就
是 A+/-；mox2cre/+的老鼠 （通过检测cre确定genotype)，发现这个老鼠有我感兴趣
的phenotype.
现在我想继续研究基因A, 还是用这个A+/-， 但是要去掉mox2-cre.可是问题来了， 这
样的下一代老鼠，我怎么检测delete呢？在不知道A-flox具体序列的情况下，我怎么能
设计引物呢？
有没有什么公司能测genome上的小段序列？因为我大致知道是A基因的哪几个exon被
delete 了。
多谢多谢！ |
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S******9
发帖数: 2837 | 50 如果原来的primer可以区分cre band， flox，wt 条带的话，可以用原来的primer做，
出现一个flox+Wt band就行。如果不能区分的话， 就要自己设计新的primer了。 |
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