s******y
发帖数: 28562 | 1 这个实验不是这么做的。因为大部分情况下面，不同的primer 所用的
PCR condition 不一样，所以不推荐在同一个cycle 里运行。
你应该是个菜鸟吧？那就不要乱改protocol 了。
这个实验应该这么做：
1. Primer gene G premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica .
2. Primer GAPDH premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica
所以要跑两次PCR. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 2 对于院长的这句话我不敢苟同
“只能用G的平均值/GAPDH的平均值。但是得到的这个平均值却没有standard
deviation”
如果照你这么说的
那还需要误差传递公式做什么 |
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S*****s
发帖数: 287 | 3 优势是什么？我只做过 realtime PCR 不做 microRNA。在我看如果用 oligodT 就可以
拿 GAPDH actin 之类的内参做 control，测出来的 specific level 也更准确一点。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 4 新手请教：
在做Polii-ChIP-qPCR,在qPCR这步怎么normalize，看protocol上建议留input，最后
qPCR这步normalize to input。可是reverse crosslink之后DNA yield这么少，留1%的
input能准么？我想请问，能不能不留input了,qPCR这步normalize to GAPDH行么，反
正treatment也不影响Polii binding.
还有另一个问题，reverse crosslink之后大家都怎样recover DNA，我过了个QIAGEN的
柱子，yield挺低的
谢谢～～ |
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g*******f
发帖数: 427 | 5 1. 关于DNA extract 我以前用QIAGEN的柱子，方便到是方便，可是费钱不说，产量还
很低。后来我一直用 phenol: chloroform，挺好用，最后一步加glycogen 和乙醇后
-20 过夜或者 -80度 1小时，离心后可以看到大砣的沉淀。
2. 关于input，1%的 lysate 可以提取很多的DNA，足够后面PCR 用了。我觉得
normalize to GAPDH 从理论上讲就错了 |
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Z******5
发帖数: 435 | 6 1）However, I do not know 聚合酶2的峰值位置，组蛋白修饰，转录因子结合?
A.这个说起来比较复杂。
a. 和转录起始位置相关的一些组蛋白修饰看这篇文献 The mammalian epigenome.
Cell. 2007 Feb 23;128(4):669-81.
b. 聚合酶2的我忘了哪篇文献了，不过很好理解，基因的转录肯定需要聚合酶2的
结合，自然就会有聚合酶2的结合ChIP数据。你可以去UCSC随便找几个熟悉的基因看看
，比如GAPDH等。
c. 转录因子的ChIP在UCSC genome browser上的数据是有限的，现在已经有几十个
转录因子了吧，这个只是参考。还是那句话，找个你熟悉的基因，看看周围的结合情况
就知道了。
d. 再提一下RIKEN的问题，你可以参考下面几篇文献
Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of
transcriptional starting point and identification of... 阅读全帖 |
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b*******s
发帖数: 954 | 7 你可以看看Dupre写的东东。
"It is not possible to reduce biological explanations to explanations in
chemistry and/or physics."
他举过一个很容易懂的例子。
比如说，我有两条腿，请问我怎么从一楼到八楼？ 如果我坐电梯，那么，我从一楼到
八楼的能力并不
来自于我的两条腿；而是来自于我的环境，有电梯可以坐。
同样的道理，一个蛋白质，究竟有什么作用，不仅仅依赖于它本身的物理和化学性质。
还要依赖于这
个蛋白质所处的环境。比方说GAPDH, 一个很普通的house keeping 酶，可以做"acyl
phosphatase", "an esterase","a protein kinase", "a Uracil-DNA
glycosylase", 很多很多的用处，根据它所处的环境。
Reductionism从某种程度上可以解释很多问题，但不是万能的。我不认为system
biology是忽
悠。。。
样。 |
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O*********e
发帖数: 79 | 8 我一般用两到三个housekeeping gene，比如actin, GAPDH，做qRT-PCR的internal
control。分析数据的时候，我分别用这几个gene来计算我的experimental genes的
fold change，然后取平均值得到最终结果。今天在网上找到一个分析qRT-PCR结果的
Excel模板，它里面的计算方法是，先把housekeeping gene的Ct value取平均值，再用
这个平均值来计算experimental genes的fold change。这两种方法最后得到的结果是
一致的吗？这貌似是个数学问题，而我每每遇到数学就头晕，所以上来问问大家的看法
，还有大家平时都用的哪种算法？先谢谢了！ |
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h*******o
发帖数: 4884 | 9 一开始做western blot的时候
转完膜把胶也染上
这样可以基本上看出loading是不是均匀
然后在和actin band比较一下就行了
个人经验 actin在大部分情况下还是最好的normalizer
GAPDH经常不太靠谱 |
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d****i
发帖数: 2346 | 10 我们现在在用b-actin。
同时想试试看b-tubulin和GAPDH，请大家推荐好用的抗体。不要偶联HRP等的。
非常感谢！ |
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s*****g
发帖数: 7857 | 12 检查出actin多了只能说你的核蛋白污染了细胞质蛋白.通常要用组蛋白等做LAODING
CONTROL, 再用actin/GAPDH等做污染检测. |
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a*******a
发帖数: 4233 | 13 少量细胞是多少？
以前用10个小鼠oocyte抽rna，用专门的微量rna 吸附柱kit
我在国内用天根，那么qiagen应该也有类似的
抽提过程加DNAse消化的,洗下来全部反转录到20ul体系
取1ul做realtime， gapdh ct大概17-18 |
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c********r
发帖数: 189 | 15 tubulin 和 GAPDH，都可以，我以前用tubulin，还行 |
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D******9
发帖数: 2665 | 16 我用了GAPDH， 核里也有， 就是WB带比较淡 |
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w***j
发帖数: 88 | 17 用GAPDH好一些的
我们不吸脂质的话就没有火箭样 |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 我的直觉就是你们可能没有在qPCR的时候做loading control
qPCR 的时候会因为样品制备和实验室试剂的差异而出现比较大的偏差，
所以一般需要一个内部control 来调整最后的值。对于你们这个实验，
是否可以考虑用host cell actin and GAPDH 来做loading control? |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 可以用 ribosomal protein L15 或者GAPDH
xdjm |
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s*********t
发帖数: 600 | 20 另外，第一次得到的上清和细胞核pellet，我们实验室还有人再次用低盐溶液洗涤一次
细胞核pellet。可是我试过一次，细胞用homogenizer捣过之后，再离心，得到的
pellet已经有黏糊糊的倾向了，是不是细胞核也破碎了？如果再次洗涤，我担心细胞核
蛋白会损失。所以我都不洗涤。
所以做western检测quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone），NE
里面混有少量CE （anti GAPDH）。
所以我现在最烦做从大量细胞制备NE，S100的实验，因为跟文献的方法总是有些修改，不同的文献使用
的方法也不同，同个实验室，不同的人用的都不同，让我无所适从。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 21 你说的QC assay是什么？
我做western检测NE和CE的quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone
），NE
里面混有少量CE （anti GAPDH）。不过这些都是粗蛋白总蛋白，怎么进一步检测呢？
我担心的一是破碎细胞之后的细胞核pellet已经像鼻涕了，是不是细胞核也被弄破了？
然后NE和CE各自有少量互相污染。
二是透析会产生大量沉淀，直接稀释也会产生很多沉淀。也许你要研究的未知蛋白就在
这些沉淀里面呢 。。。
我查了n多文献，从80年代的方法到现在的，都不相同。同一个实验室，不同人各自的
做法也有差异。
无所适从啊。 |
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m***o
发帖数: 272 | 22 用actin, GAPDH, TATA Binding protein(TBP), and 18s rRNA. Actin and tbp 显示
类似的降低，但是18s没变化。该选用那个来normalization呢？很多文章用18s，大家
用的时候是不是你的target gene 用1ulRT产物，而用18s的时候要稀释至少100倍呢，
不然Ct就在10，会不会因为量太高而显示不出该有的差异呢？作的是WT和knockout 老
鼠的liver，大家有没有什么好的建议？谢谢！
感觉选不好normalization， 做实验就好像有个定时炸弹在旁边一样不舒服。谢谢任何
建议！ |
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h****k
发帖数: 182 | 23 如果不调的话， 有GAPDH作为control 结果影响大不大？今天就忘记调了。 |
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E*****e
发帖数: 54 | 24 克隆好几个基因，RT-PCR能检测到基因表达 （ct～29， GAPDH ct～18），但用PCR （
35 cycle）一个都没能克隆出来。
请教一下从自制cDNA文库中克隆基因有什么窍门吗？ |
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E*****1
发帖数: 610 | 25 I think something with membrane?
I bought pre-made membrane all the moluclar weight around 43-20 KD is
nothing, But I can get tubulin
Another question, except actin and GAPDH
what else I can use for control? |
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M*****e
发帖数: 279 | 26 我有类似的经历：检测不到一个ATCC cell line 的 beta-actin。
Cell line: SW780 (human urothelial carcinoma).
I bought this cell line twice from ATCC, but I could not detect beta-actin
at all. The expression of beta-actin as shown by Western blot in this cell
line was reported in the literature.
I could detect GAPDH in this cell line.
I could use the same beta-actin antibody (Sigma) to detect beta-actin in
other human cell lines (urothelial and non-urothelial carcinoma) using the
same antibody (Sigma).
I don't thin... 阅读全帖 |
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c********b
发帖数: 363 | 27 可不可以在GFP和actin之间放一个3c protease的site，比较切或者不切情况下actin的
强度（都normalize到GAPDH）变化。 |
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s*****a
发帖数: 59 | 28 要做qRT-PCR检测一个gene expression level，请问negative control Ct要比sample
Ct大多少才能接受？我要检测一个gene的alternative spliced isoform，其中一个
isoform 1 的扩增结果会被平时用的plasmid污染，另一个 isoform 2 可能会受
genomic DNA污染。如果检测isoform 1，RT minus control的Ct value只比样品晚3个
cycle（Ct sample=26, Ct RT minus control=29, Ct GAPDH=17），相当于污染物是样
品target gene的1/8，这个污染程度能否接受？
另外我的total RNA做过turbo DNase digestion，如果要检测可能受到genomic DNA 污
染的isoform 2, 请问RT minus control的Ct值比样品大几个cycle才能接受?
补充一点，negative control melting peak已经确定不是primer-dimer而是target
ge... 阅读全帖 |
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H****n
发帖数: 26 | 29 多谢你的的回复！
我的positive control就是用anti-polII 拉下GAPDH的 TATA box region. 另外，我的
anti-HA 和 IgG都是Rabbit的，是否IgG这里会产生背景？
现在我在设计Q-PCR的引物，具体看看定量。老板还要我用这个模型做ChIP-seq，现在
这个enrichment的效果真让我不敢想象。
PS：我自己做了一个Knock-in 的老鼠，让那个TF带有HA fusion.
欢迎继续交流！ |
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T****a
发帖数: 409 | 30 最近在做epithelial cell fractionation。
cytoplasmic的loading control可以用GAPDH。
但membrane和nucleaus的loading control最好用什么呢？ |
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a*****x
发帖数: 901 | 31 不是最常用的那个KDalert GAPDH Assay Kit吗 |
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T*****u
发帖数: 3257 | 32 i used Na/K ATPase and GAPDH as marker for membrane and cytosol marker. |
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Z******5
发帖数: 435 | 33 貌似扩增的最猛的那几条曲线有两个指数增长区。 会不会是有超强的引物二聚体？你
检查一下引物看看。
一般用2ug total RNA反转录cDNA后，1:10稀释，取3ul做模板，内参GAPDH的Ct也就20
左右。 按照模板差10倍，Ct值差3来看，你这个结果真的是不好解释啊，即使是过表达
也没见过这么高丰度的基因。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 34 没做过NGS，但是看过一篇cell paper：A Mammalian microRNA Expression Atlas
Based on Small RNA Library Sequencing，再结合一些已有的miRNA文献研究，感觉这
个NGS的数据质量非常高啊。
不清楚NGS那些miRNA的copy数是怎么来的，有没有用内参，用的是什么内参。
反正普通qPCR就用GAPDH，actin之类的做内参貌似不是很靠谱。
现在有一些qPCR array，都会带有结果计算软件，可以从array的分析中自己去选定内
参。 |
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l*******i
发帖数: 153 | 35 给nature写信，估计也难撤稿。
去年发在cell stem cell上的那篇用miRNA诱导iPS的文章，也发生类似的错误，REX1这
个基因，他们的引物就用错了。正确的应该是ZFP42，结果Blat一看，他们用的引物是
amplify REXO1的。qPCR的内参GAPDH，其引物有一个碱基mismatch。发信过去询问，作
者根本不回应。 |
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s*******2
发帖数: 598 | 36 最近我在做Western blot试验时，发现我的细胞在用药物CDDP处理48hours 后，Actin
band消失，但是control cells仍然有，原因何在？
Is it means actin is not a good loading control , I need to switch to GAPDH,
Tubulin as a loading control?
Thanks for your suggestions. |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 Actin 是一个非常好的loading control, 也是一个细胞生存需要的关键蛋白之一，能
够使得这个蛋白彻底看不见了是一件非常奇怪的事情。除非细胞被药物处理之后
彻底坏死导致所有actin 都被降解了。你说的那个CDDP是什么药物？
Actin
GAPDH, |
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A******y
发帖数: 2041 | 38 Are they the same loading? If your lysates don't have any protein left, of
course you won't have any actin band. Btw, don't assume every lab do BCA or
Bradford before western...
Actin
GAPDH, |
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T****r
发帖数: 4006 | 39 Cisplatin貌似是很久前用的一种抗癌药。
很多常见的house keeping genes,比如actin, tubulin,Gapdh并不是一成不变的，这些
基因也会被调控，包括transcriptional and posttranscriptional的调控，有些细胞
（比如脂肪细胞）只有很少量的actin and tubulin，还是可以继续活着的。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 40 http://en.wikipedia.org/wiki/Cisplatin
Cisplatin, cisplatinum, or cis-diamminedichloroplatinum(II)[1] (CDDP) (trade
name Cisplatin,brand name Platin marketed by Cadila Healthcare according to
FDA Orange Book) is a chemotherapy drug. It was the first member of a class
of platinum-containing anti-cancer drugs, which now also includes
carboplatin and oxaliplatin. These platinum complexes react in vivo, binding
to and causing crosslinking of DNA, which ultimately triggers apoptosis (
programmed cell... 阅读全帖 |
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g**c
发帖数: 144 | 41 换一抗试试看？随便找谁借点儿别的公司的。也许药把这个公司的 antibody 所识别的
actin 的 epitope 给搞得认不出了。。。或者甚至直接用药处理 control cell lysa
te，看看 actin 条带会不会消失。
Actin
GAPDH, |
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s*******2
发帖数: 598 | 42 Updated: I tried using Santa Cruz GAPDH(anti-rabbit) as loading control on 1
/24 and 1/25, it is fine. |
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S*********s
发帖数: 304 | 43 多选几个内参
b2m
18sRNA
GAPDH
看看内参之间是否一致。
一般尽量保证input RNA量是一样的 |
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a****n
发帖数: 79 | 44 18S RNA一般只用在northern blotting里做内参吧, RealtimePCR还是actin,GAPDH,
tublin做内参比较常见 |
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z*******6
发帖数: 679 | 45 大家觉得气泡真会影响结果吗？难道不应该被煮出去吗？... 我一直不明白，虽然我每
次上机前都3-4000 rpm离一下心，但是bubble有时候还在... 貌似室温离就能消除气泡
，但是我真的怀疑气泡到底对最后结果有多大影响...
我每次内参，比如GAPDH这种，triplicates重复性非常高，也就差0.0几... 但是我的
gene of interest variation也会到0.5，而且我是做老鼠器官的，反正肯定要用n只老
鼠才能看到2倍左右的差别，triplicates重复这样我也就无所谓了... |
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z*******6
发帖数: 679 | 46 我到最后一步加cDNA模板时，都用排枪加2 ul... 这个variation本身估计就不小...
但是我现在ct variation只要在0.5以内，我都认了... 尤其是GAPDH没什么variation
的情况下... 就是我的基因比较tricky而已... |
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l**********t
发帖数: 138 | 47 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右，18s在12左右，我觉得蛋白表达应该不会很强 |
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y****i
发帖数: 2194 | 48 如果你gapdh在16左右，目标蛋白在32，95%以上的机会你直接做western是看不到蛋白的
这么说吧 ct值低 不代表你一定能检测到蛋白（由于其他人谈到的各种primer，蛋白降
解等等原因）
但是ct值高于30了，基本可以代表你用straight wetern检测不到蛋白
但如果你可以先IP，或者用其他的方法enrich你的蛋白 还是有可能的 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 49 完全可能检测到
蛋白降解速度不确定.
抗体效价不确定
这些都是影响wb的重要条件
我们有做gapdh ct15, candidate32-34的一个基因 |
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l******g
发帖数: 1145 | 50 我现在在做些ex vivo的实验，就是把mouse的主动脉分离出来后，放在培养基里养三天
，同时加药。三天后收集样品提rna,然后profiling下各基因的表达，看是否和in
vitro的结果一致。
如果分离主动脉后立刻提rna,结果一直很好。但现在ex vivo养了几天后，碰到了些问
题。
1,培养几天后，能提出来的rna量急剧减少，感觉养几天后组织不是很健康的原因。少
归少，但还是够做rt之类的后续。
2,我通常用18S和gapdh做realtime pcr的内参。但郁闷的是，在加药处理的样品里，这
两个基因的表达也呼呼的往上升，甚至比要检测的其他基因升得都要高。以至于
normalize后，根本看不到变化，甚至是相反的变化。ps，在做rt的时候，每个样品我
都加了相同量的rna，按经验来说，内参应该非常接近，曲线几乎都重合在一起才对。
现求问怎么破？
我感觉技术上没什么问题，最简单的就是换一个比较stable的内参（尤其是心血管系统
内的）。
求有经验的推荐！一经验证work的话，双黄包奉上！ |
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