s******s
发帖数: 1584 | 1 挺正常的，我都是按BCA 走一遍ACTIN 或者GAPDH 再按loading control 再RUN 一遍 |
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q******g
发帖数: 3858 | 2 我也是这样。如果两个蛋白分子量差不多，就换个loading control. GAPDH 37Kd,
TUBULIN50Kd, 差别还是够大。
如果做phosphorylated protein, 我还是建议strip。 |
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l***y
发帖数: 4671 | 3 also 2nd this。这就是用不同的 dynamic ranges 来区分。具体的计算是：比如说，
要看的 protein 需要 5min 曝光，而 house keeping protein 只需要 5S，就可以不
用 stripping 了。最糟的情况下由这种方法带来的误差也不太可能会超过 1/60 也就
是 1.7% （除非 GAPDH 上的 non-specific binding 比 target protein 还要强 --
那也是可以估算的）。而对于 WB，只要方法带来的误差不超过 5%，就可以忽略之。想
要更精确的结果，只需要调节一抗的浓度来加大弱信号和强信号的信号比就可以。 |
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I*******U
发帖数: 869 | 5 最近要提取从白色脂肪里面提取SVF，根据protocol我确实看到了pellet，用TRI-
reagent也提取到了mRNA,nanodrop测出的浓度有800ng/ul，但是我试了cyclophilin，
gapdh，18s几个内参，都测不到CT值。已经重复几次了，郁闷的不行。请教各位，有什
么建议么？
SVF protocol
1）isolate WAT,
2) Incubate tissue @ 37C for 45min with shaking @ 80 rpm （Collagenase I，
1mg/ml）
3）300g for 10min
4) Dissolve pellet in Tri-reagent. |
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I*******U
发帖数: 869 | 6 现在不是组织解离不够，我能拿到细胞，也能测到RNA 浓度，可是housekeeping gene
18s，GAPDH和Cyclophilin都测不出，这个是什么原因？
楼上的你有没有测过SVF的gene表达呢？用什么housekeeping gene呢？谢谢
ml |
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q******g
发帖数: 3858 | 7 半天做完没问题。但也就用来看看GAPDH， TUBULIN之类，其他的我信不过。 |
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b*********2
发帖数: 35 | 8 1. 大家平时都用BCA来检测蛋白浓度吗？有什么准确的方法？
2。 除了beta-actin， GAPDH，还有什么house-keeping marker吗？
3。 对于ECM 蛋白检测，用什么内参呢？
谢谢了。 |
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l**********x
发帖数: 28 | 9 拼接肯定是拼接，但ES和MEF的GAPDH本身也不一样（大小或是相对于total的量），所
以这没什么
supplementary |
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l**********t
发帖数: 138 | 11 我的意思是，我不知道那家伙是怎么把Ct做到30以上的 |
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d****7
发帖数: 109 | 12 有可能是引物不咋样，重新设计个引物，或者干脆花钱买现成的好引物 |
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l********e
发帖数: 415 | 13 Dissociation curve 有看到产物么 ... |
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l**********t
发帖数: 138 | 14 我不怀疑引物，google scholar搜索有2330篇文献用这对引物
我自己做过Ct值一般在15-17左右，我就是不知道那伙计怎么做出30多的 |
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n********e
发帖数: 1630 | 18 标准曲线呢？ 30以上的CT应该就是noise吧 没有template的sample也是32-35 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 19 这种应该是cDNA里面有抑制pcr的东西了吧
你有其他基因做出来低于20或者25的吗？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 20 这玩意把原始数据拿出来看看就知道了，估计是效率问题 |
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f*******e
发帖数: 354 | 21 ppt点crop可以还原原图，因为作者没有压缩，没有去掉裁掉的图
里面还有其他样品好多条带 然后gapdh只有三个，这几个估计还算认真造假的，其他的
是在太过分了，简直了。。。
blot.
a- |
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g******r
发帖数: 139 | 22 谢谢你的建议。我知道qPCR的efficiency, 但确实没有测过各个primer的efficiency到
底怎么样。但理论上effiency对Absolute Quantification影响很大，而对ddCT方法的
影响有限。而我就只用ddCT方法比较各个gene在不同条件下的表达，没有去比较基因间
的表达。至于ddCt的方法有人要argue有缺陷，不理想，那是另外的话题 (体外话，我
发现没有测primer效率的人不在少数，当然绝大部分人也是用ddCt)。
以一个简单的knockdown为例，设目标gene表达量为X0，在Ct时的PCR产物为Xt0，效率
为EX, reference gene的表达量为R0，在Ct时的PCR产物为Rt0，效率为ER；在
knockdown情况下目标gene表达量为X1，在Ct时的PCR产物为Xt1, reference gene的表
达量不变，仍然是R0，在Ct时的PCR产物为Rt1 (两次的Ct可能一样，也可能不一样)。
Xt0=X0 (1+EX)CtX0, Rt0= R0 (1+ER)CtR0 ;Xt1=X1 (1+EX)CtX1, Rt1... 阅读全帖 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 23 要不
1。固定，打孔，直接免疫荧光染色，照相？（你会需要一个cytospin的机器把悬浮细
胞离心到玻片上）
2。或 IP-Western
3。 或针对此蛋白做细胞的免疫荧光染色， 再做Flow cytometry
4。灵敏的 ECL 液体也是关键。反正GE 的ECL不行。 我平时都是用GE的加少量
MILLIPORE的。MILLIPORE的太强了，有杂带，还需要更好的分子量marker. （GE的我们
是专门用
来显GAPDH，ACTIN等常规大量蛋白的） |
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L****T
发帖数: 169 | 25 Western条带定量当然好，只是个人觉得意义不大了。我举个例子，细胞经过处理后某
条带强度增加2倍（normalized by actin或Gapdh），且不说独立重复，即使同一张膜
，重新再曝光一次，时间短点或者长点，可能就变成4倍或1.5倍了。 |
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D******9
发帖数: 2665 | 26 要是想看一下， 蛋白表达量的变化， 用GAPDH做对照。 3次biological试验的结果，
用那个统计test比较好， 谢谢。 |
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T*****e
发帖数: 247 | 27 对照比实验 两组的话 就 student's t-test
多组之间互比的话 就上anova
当然你应该先normalized到GAPDH保证上样量一样
楼上有人说显著性差异大到应该看看就出来了，这是吹毛求疵，统计学的意义可不是一
个显著性差异带给你一个生物学差异，而是保证你分析的样品数量足够证明你观测到的
到底是不是一个偶然事件
按说还应该看看样品定量是否符合特定统计学检测要求的分布，当然一般三个样也未必
能看出什么分布就是了，全都默认符合正态分布了，虽然未必真的如此 |
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D******9
发帖数: 2665 | 28 要是想看一下， 蛋白表达量的变化， 用GAPDH做对照。 3次biological试验的结果，
用那个统计test比较好， 谢谢。 |
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T*****e
发帖数: 247 | 29 对照比实验 两组的话 就 student's t-test
多组之间互比的话 就上anova
当然你应该先normalized到GAPDH保证上样量一样
楼上有人说显著性差异大到应该看看就出来了，这是吹毛求疵，统计学的意义可不是一
个显著性差异带给你一个生物学差异，而是保证你分析的样品数量足够证明你观测到的
到底是不是一个偶然事件
按说还应该看看样品定量是否符合特定统计学检测要求的分布，当然一般三个样也未必
能看出什么分布就是了，全都默认符合正态分布了，虽然未必真的如此 |
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n******e
发帖数: 110 | 30 怪我没有讲清楚。我是想问，对于用WB半定量比较某个蛋白在正常组织和肿瘤组织的表
达量，一般是用某个house keeping做参照还是控制不同样品的总的蛋白量一致。
多谢你的回答，看来你看文献多是用总蛋白量一致，我看了一些，好多是用actin/
GAPDH之类的做参照。
公司提供的裂解蛋白总蛋白量应该是对的，只是不同分子量的蛋白丰度在正常组织和肿
瘤组织差别很大。所以我发现没有办法用actin做参照，总蛋白量一样的情况下，相差
几乎有十倍。
对于这种临床蛋白样品，是不是很多都是这样的？ |
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x*****d
发帖数: 704 | 31
你得考虑ACTA1对你的样品来说是不是一个好的loading control。先换一个control试
试，比如GAPDH |
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n******e
发帖数: 110 | 32 怪我没有讲清楚。我是想问，对于用WB半定量比较某个蛋白在正常组织和肿瘤组织的表
达量，一般是用某个house keeping做参照还是控制不同样品的总的蛋白量一致。
多谢你的回答，看来你看文献多是用总蛋白量一致，我看了一些，好多是用actin/
GAPDH之类的做参照。
公司提供的裂解蛋白总蛋白量应该是对的，只是不同分子量的蛋白丰度在正常组织和肿
瘤组织差别很大。所以我发现没有办法用actin做参照，总蛋白量一样的情况下，相差
几乎有十倍。
对于这种临床蛋白样品，是不是很多都是这样的？ |
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x*****d
发帖数: 704 | 33
你得考虑ACTA1对你的样品来说是不是一个好的loading control。先换一个control试
试，比如GAPDH |
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c********y
发帖数: 22 | 34 模版每个体系加40ug，刚开始我确实加太多了，在1kb那里有条带就以为是目的条带，
还一本正经割胶回收连接，后来才意识到可能是基因组dna而已，现在gapdh扩得很好
引物gc含量基本都在50-60之间我觉得可以接受吧，引物blast过，都有15个碱基错配，
可是我的目的片段就那么长，能设计的都设计了，再设计就不是那块区域了 |
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c********y
发帖数: 22 | 35 dna重新提过了，用试剂盒提的，感觉应该还好吧，gapdh扩得挺好的。
我试试，不停重新定酶怕老板批啊。。。 |
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发帖数: 1 | 36 比如一个384孔板，一个sample至少要6个孔（3 replicates for target gene and 3
for gapdh control）
这样最多能同时做64个样本
但如果超过64个样本怎么办呢？那就只能分两批做，可是这样会有batch effect，就是
每一“锅”的qpcr都是不太一样的，两“锅”data直接拼到一起比较，是不是有问题？
有没有啥好办法remove batch effect呢 |
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r**********e
发帖数: 587 | 37 在用psicheck2这个dual luciferase研究我的5‘UTR的SNP对于基因表达的影响；
Renilla和Firefly都是在一个plasmid上的，但被两个不同的promoter驱动。5’UTR放
在Renilla前面，而Firefly作为internal control可以控制sample amount之类的因素
Plasmid1: PromoterA---5'UTR-SNP1---Renilla---PromoterB---Firefly
Plasmid2: PromoterA---5'UTR-SNP2---Renilla---PromoterB---Firefly
现在的问题是，我用“同样量”的Plasmid1和Plasmid2来转染，也是大致“同样数量”
的细胞，可总是发现Plasmid1的Firefly level总是Plasmid2的两倍多；换句话说，我
觉得我作为internal control的Firefly也受到SNP的影响。
另外，其实我的这个5'UTR是类似G-quadruplex的区域，大概2KB（占了整个plasmid的1
/4），我很肯定... 阅读全帖 |
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r**********e
发帖数: 587 | 38 我想问一下，那么用单荧光单人，都是如何进行control的呢？
可以用gapdh这种内参来control细胞的量
然后转染的时候很小心的用equimolar amount的plasmid保证转染进去的量是一样的
我们用同样的细胞的量，同样的plasmid的量去转染，那么firefly的表达量也应该是一
样的吧？ |
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发帖数: 1 | 39 研究noncoding序列，因为各种原因无法使用dual luciferase；所以想直接用single
luciferase（比如Renilla）
问题是，对于single luciferase应该如何对照才有说服力呢？翻了半天过去的文献都
没找到
我能想到的一个是细胞使用量，这个用GAPDH就可以control
还有一个就是转染的plasmid的量，这个我转染的时候保证同样molar的就是同样数量的
plasmid进入细胞；具体做法就是nanodrop测得plasmid的质量，然后除以分子量。请问
这样的做法大家买账吗？
谢谢 |
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发帖数: 1 | 40 我用的是psicheck-2的质粒，就是Renilla和Firefly在同一个plasmid上。Renilla是
control
我研究的这段noncoding序列有复杂的secondary structure，而且大概2kb，所以很可
能这样的序列会影响整个psicheck-2的空间结构和表达，包括作为internal control的
Renilla。
psicheck-2-noncoding-SNP-A和psicheck-2-noncoding-SNP-B，每次我用相同量的质粒
，相同数量的细胞转染，这个internal control的Renilla总是有明显差别；所以觉得
这里的control是没用的，但同时也说明在转录水平SNP-A和B有差别。
所以我的问题是：
1. 还是用这套系统，但我做RNA level的qPCR，我用GAPDH来控制细胞数量，同时我保
证转染加入的plasmid是相
同的量，那么我做出来的表达差别是否可信？可否发表？
2. 当然我可以重新找一个single Renilla vector，把noncoding插到这个vector上，
然后co-tran... 阅读全帖 |
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l********e
发帖数: 415 | 41 Gapdh表达并非永远不变 这种情况下用点别的基因作normalization就好了 |
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r**********e
发帖数: 587 | 42 DNA template做in vitro transcription，做完后，用bio-spin column去除single
nucleotide；
我这里是要比较SNP对于IVT的影响
那么接下来如何定量呢？用nanodrop定量，可以吗？
RNA浓度很高（IVT一般都产生大量RNA），nanodrop定量大概500ng/ul
总担心nanodrop不够accurate；但对于这么大量的IVT RNA， 难道用qPCR呢？我们做一
般total RNA 的qPCR，是要gapdh这样的control的，但IVT RNA，就一种sequence。。
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C****7
发帖数: 270 | 43 我想卖的物品:
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