n******7
发帖数: 12463 | 1 最近处理一些数据，鉴定到了几百个unique的transcripts，对应一百来个基因。这样
很多
transcripts其实是一个gene的不同isoform。现在因为要annotate这些isoform而有些头
疼。
1. 哪里有高质量又比较全的isoform数据呢？
我希望用已知的isoform的一个集合做reference，来确定我们鉴定的isoform，哪些是
之前已
经被发现的，哪些是我们新近鉴定出来的。
我个人喜欢用RefSeq数据，但是挑了几个基因，发现RefSeq记录的isoform数量还是挺
少的。
UCSC Known gene没有经过human curation，很多记录仅仅基于genbank数据。我担心会有
很多artificial的序列
GenCode/ENSEMBLE 数据，一直没太搞明白，Gendoce的level 1+2的数据似乎质量还可
以，
但是也不知道他们具体的annotation的流程
CCDS似乎就是ENSEMBLE和RefSeq的交集，coverage估计是个问题
Alternative Splicing的数据我不太熟悉，看过一些数据库，很... 阅读全帖 |
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d****i
发帖数: 2346 | 2 某基因S有三个isoform，我们western在细胞里只能看到2个isoform(1和2)的条带。
isoform 1
最长，isoform 2比1在N端少了一段，isoform 3又比isoform2在N端少了一段，也就是1
-2-3依次在N端少了一段。
然后从Dharmacon order了siRNA smartpool，KD以后western发现只有isoform 2被KD了
。理论上应该2被KD了，1肯定就被KD了。
请教有什么可能原因isoform1的蛋白水平仍然不变？
谢谢！ |
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y*********u
发帖数: 183 | 3 在研究一个蛋白
文献报道有两个isoform ，A和B
isoform A所有exon都表达
isoform B发生了两个splicing event
我现在疑问的地方就是觉得可能存在另外两个isoform ：因为从序列特性上来说，两个
spicing event都可以独立发生
在这种情况下，要去哪些数据库中dig out可能的spicing event 呢？ |
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s********9
发帖数: 132 | 4 Evidence for isoforms:
1: western blot shows two bands.
2: both bands sensitive to siRNA-1, only one band sensitive to siRNA-2.
the isoforms listed in Genebank do not explain these observations, which
suggests a new isoform. What would be the routine experiment to identify
this new isoform?
Thanks a lot. |
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s********9
发帖数: 132 | 5 Evidence for isoforms:
1: western blot shows two bands.
2: both bands sensitive to siRNA-1, only one band sensitive to siRNA-2.
the isoforms listed in Genebank do not explain these observations, which
suggests a new isoform. What would be the routine experiment to identify
this new isoform?
Thanks a lot. |
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s********9
发帖数: 132 | 6 I know the sequence of both siRNA.
I want to clone this unrecognized isoform and express it to study its
function.
BTW, how do I do sanger seq to get the seq of unrecognized siRNA-insensitive
isofrm? (product is smaller than all reported isoforms)
And can Mass Spectrometry identify the sequence of this unrecognized isoform
(let's call short form)?
WHat i worry about is the contamination from reported isoform (let's call
full length) |
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n******7
发帖数: 12463 | 7 1. 最好先根据siRNA的靶点估测一下这个isoform的序列构成
在某个coding exon上面最好
2. 如果大致确定是alternative splicing，而不是5'-/3'-的变化
可以根据全长isoform 的ORF设计引物做RT-PCR
如果这个short-form 表达量不是特别低的话
做一定数量的clone就可以抓住了
后续你怎么玩都可以了
3. 可以同时做一些bioinfo的分析
比如这个AS event很可能对应新的splicing junction
可以看一下已有的RNA-Seq data里面这个junction的表达情况
由此可以大致推断这个isoform是不是functional的
另外，也可以居然protein sequence的变化，看看是不是有些domain被打乱了
这样的话有可能跟全长蛋白功能相反的，这是比较有意思的一种情况
insensitive
isoform |
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n********0
发帖数: 11 | 8 I used qPCR detected two isoforms , both expressing in cell.
What methods can be used to detect the isoforms in protein level.
One isoform is full length and the other is missing some middle parts about
20 AA. There is no antibody available.
Thanks all big niu people, please help !! |
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m*******d
发帖数: 4 | 9 很多基因如fgf2可以从同一个transcript不同的start condon开始翻译，有人称之为
alternative translation。这种情况肯定可以称之为isoform...
另外，很多其他isoform如PLCbeta,gamma也不一定是alternative splicing啊 |
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m*********7
发帖数: 606 | 10 从个人经验说吧，我认为目前对于isoform的归纳总结极少，历史上遗留下来的问题极
多，而且很多人不在乎。你所提到的那些问题如果想得到答案，必须自己去下功夫挖了。
当年我做一个基因，文献历史就已经很传奇了。最早从cDNA库调出的两个基因，其中一
个在九年后被人发现有严重测序错误，另一个11年后被发现是从rat cDNA库里调出来的
（最早被当做人的基因发表）。我根据那11年后宣称是人的基因去做克隆，死活做不出
来。最后才发现这是一个只在个别组织里表达的特定isoform，不是普遍表型。直到今
天NCBI里的记录都是不正确的。
后来做几个别的基因，都或多或少有类似问题。搞得我现在每次都是在NCBI里把所有相
关记录都翻出来仔仔细细看，并且恨不得每个基因都自己做一遍5'-RACE和3'-RACE。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 12 据我的理解，现在大家还处在直接ignore 大部分isoform的阶段，实在躲不开了就自己
深入研究一下那个基因，基因组水平的annotation高质量的还没有吧。一般就是用est
拼出来的？
楼主如果你发现了一种高通量annotate isoform的方法，应该可以发一篇很不错的文章 |
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b****r
发帖数: 17995 | 13 如果片段不是太大，设计引物巧妙一点，几对引物就能试出来是不是有某种isoform
不过这种课题是不是意义不够重大，除非你前期已经有很多工作，有证据表明如果有这
种新isoform存在会很有意思 |
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B****n
发帖数: 22 | 14 想检测较大isoform表达变化，但是手里的抗体同时识别两个isoform。
蛋白100KD左右，大的比小的多40个氨基酸。
有经验的指点下， 不胜感谢 |
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m******5
发帖数: 1383 | 15 我有个蛋白，已知有两个isoform,A form是全长，B form是trancated 的Aform
请问要如何设计探针tell them apart呢？它们的中间片段并没有区别 |
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Y*Z
发帖数: 1301 | 16 where can I find protein isoform information?
Thanks |
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c********r
发帖数: 189 | 18 在用多抗的时候通常有很多带，如何区分杂带和isoforms呢，或者是蛋白剪切的产物。
多谢 |
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c********r
发帖数: 189 | 19
就算是质谱，如何区分降解蛋白带和不同isoform带呢？ |
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s****l
发帖数: 10462 | 20 记得有一个database，提供了各种病症相关的基因的NM# (clinic isoform)
没有了bookmark找不到了。包子求一个。谢谢 |
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l***y
发帖数: 638 | 21 做全长mRNA的RT，或者单独把siRNA2的binding区RT-PCR弄出来去测序
话说不是啥重要蛋白的isoform有人关心吗？ |
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s********9
发帖数: 132 | 22 The reported mRNA isoform should be targeted by both siRNAs.
The unreported one is insensitive to siRNA-2. I should've made it clear. |
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l***y
发帖数: 638 | 23 做全长mRNA的RT，或者单独把siRNA2的binding区RT-PCR弄出来去测序
话说不是啥重要蛋白的isoform有人关心吗？ |
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s********9
发帖数: 132 | 24 The reported mRNA isoform should be targeted by both siRNAs.
The unreported one is insensitive to siRNA-2. I should've made it clear. |
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n******7
发帖数: 12463 | 25 可以预测一下siRNA-2的target site
然后看在哪个exon上
可能是exon skipping的事件
这是最简单的情况
复杂的就很复杂了
你可以测序验证
如果是有生物功能的isoform的话 还是有点意思的 |
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s*****a
发帖数: 59 | 26 要做qRT-PCR检测一个gene expression level，请问negative control Ct要比sample
Ct大多少才能接受？我要检测一个gene的alternative spliced isoform，其中一个
isoform 1 的扩增结果会被平时用的plasmid污染，另一个 isoform 2 可能会受
genomic DNA污染。如果检测isoform 1，RT minus control的Ct value只比样品晚3个
cycle（Ct sample=26, Ct RT minus control=29, Ct GAPDH=17），相当于污染物是样
品target gene的1/8，这个污染程度能否接受？
另外我的total RNA做过turbo DNase digestion，如果要检测可能受到genomic DNA 污
染的isoform 2, 请问RT minus control的Ct值比样品大几个cycle才能接受?
补充一点，negative control melting peak已经确定不是primer-dimer而是target
ge... 阅读全帖 |
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t*d
发帖数: 1290 | 27 each gene in human may have a few different isoforms. Usage of different
isoforms may be associated with human disease. Currently, there is no
reliable tech to call these isoforms with high accuracy. Illumia's reads are
too short, which makes it difficult to reliably assembly isoforms. If the
read can be longer enough, then each read could be a isoform and the problem
solved. |
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m****M
发帖数: 360 | 28 我曾经试过一些我们感兴趣的基因的引物，有将近一半不行。还不如我自己设计的CT值
低。你看他们给的扩增曲线没有？CT值和扩增曲线看着挺好的，但是都是给的一个WELL
的。我完全根据他们的，好多都比他们给的要多几个CT，有的根本没有扩增。最要命的
是这些引物没有考虑基因的ISOFORM。只是检测一个ISOFORM，或几个ISOFORM相同的地
方，有时差别不是很明星。我曾经遇到很多情况，就是某些基因的某些ISOFORM表达差
异还是很大的。 |
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a********d
发帖数: 8 | 29 因为快要毕业了，想把手头的数据尽快投出去。传统的mass spec寻找两个isoform的结
合蛋白，发现某个蛋白倾向于结合其中一个isoform. 证明了在cancer cell里是
constitutive binding, knockdown蛋白会影响这个isoform下游signaling, cell
growth, 但不影响另一个isoform下游的signaling. 没有in vivo animal data. 想请
问大家这样的数据适合投哪些杂志？请轻拍。谢谢指点！ |
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c******n
发帖数: 5697 | 30 【 以下文字转载自 WaterWorld 讨论区 】
发信人: chairman ( 8====o ~~ /*\), 信区: WaterWorld
标 题: 奥运药检基本是个笑话
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Aug 1 04:04:39 2012, 美东)
要知道，现在运动员人人都在用的是HGH生长激素，这是人体自然分泌的激素
但是自然分泌的HGH有两种isoform， 不同的molecular weight，人工的HGH只有一种
molecular weight，所以要测只能测这两种isoform的比例
人体适应能力很强，打一针HGH后，过了一星期这两种isoform的比例就回归正常了
所以运动员们都是比赛一星期前打针，一星期后身体里自然HGH比例正常，根本测不出来 |
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x*****d
发帖数: 704 | 31 上IGV看了一下，老鼠的这个基因貌似有三个isoforms。isoform之间的唯一区别就是有
一个exon的位置稍稍不一样。有两个isoform的TSS都是完全一样的。这对实验设计要求
特别高。胖老师果然厉害！ |
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c******n
发帖数: 5697 | 32 要知道，现在运动员人人都在用的是HGH生长激素，这是人体自然分泌的激素
但是自然分泌的HGH有两种isoform， 不同的molecular weight，人工的HGH只有一种
molecular weight，所以要测只能测这两种isoform的比例
人体适应能力很强，打一针HGH后，过了一星期这两种isoform的比例就回归正常了
所以运动员们都是比赛一星期前打针，一星期后身体里自然HGH比例正常，根本测不出来 |
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g**********t
发帖数: 475 | 33 谁说没蛋白产物就没有意义阿。有一个假说是AS相关的NMD是一种重要的调节基因表达
的机制。比如你的基因在testes里“需要”降低表达量，于是进化出一种isoform，而
这种isoform由于含有PTC会被NMD降解。这样功能产物的表达量就降低了，而且非功能
isoform被降解了，所以也没啥副作用（除了多耗了点能量）。 |
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h******y
发帖数: 351 | 34 Metabolism: Warburg effect revisited
http://www.nature.com/nrc/journal/v8/n4/full/nrc2364.html
It was Otto Warburg who first noted the difference between metabolism in
cancer cells and that in normal adult tissues: cancer cells take up glucose
at higher rates than normal tissue but use a smaller fraction of this
glucose for oxidative phosphorylation.
But how do tumour cells achieve this altered metabolic phenotype? The
authors reasoned that tumour tissue switches pyruvate kinase expression from
... 阅读全帖 |
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t*d
发帖数: 1290 | 35 Are you from Affy? :-)
I had similar thoughts as yours. But now I am being convinced that NGS is
out-performing microarray from any angle.
Affy's isoform array has been in market for > 6 years. But only a few
reports found some thing using that platform.
I also heard some negative views on NGS for isoforms. I guess maybe the
issue is the isoforms of RNA are too complicate to be understood under
current theory frame.
Regarding accuracy and sensitivity, with the increasing of depth of
sequencing,... 阅读全帖 |
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p****p
发帖数: 3360 | 36 1. 前面有一个人说得好，要仔细查看是否有alternative splicing导致其他isoform
增多，而你检查的isoform随之下降了。也就是说，看看你检查的mRNA和protein是否来
自同一个isoform。
2. 另外看看你的蛋白是否有转录后调控的功能。看看它是否能反馈调节自己。
3. 你的蛋白是生物钟调控的。你的mRNA，蛋白取样的时间不一样，所以丰度高低也就
不同了。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 37 sure Hsp90N
LZ
pls refer one review:
PMID 19179103
by Li Y et al. (2009).
Drug Resist Updat. 12: 17-27.
its pp22 right column bottom:
>Another cytoplasmic variant in mammals, Hsp90N, completely lacks the N-
terminal ATPase
domain and appears to be membrane associated (Grammatikakis et al., 2002).
Higher
eukaryotes possess a distinct endoplasmic-reticulum isoform, Grp94 (Ni and
Lee, 2007) and
a mitochondrial isoform, Trap1 (Felts et al., 2000). Neither clientele nor
the biological role of
these i... 阅读全帖 |
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l***s
发帖数: 841 | 38 That's weird. We have tried thousands of primers from the database, and they
mostly worked well (>90%). As to isoforms, the primers were designed to
cover all known isoforms of a gene based on NCBI RefSeq. This was done by
designing primers from the common regions of all isoforms. Not sure why your
Ct values are low. Did you follow the protocol from the website (primer
conc, annealing temperature, etc)? Another consideration is that not all
genes are expressed in all cells.
WELL |
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l***i
发帖数: 36 | 39 We already know there is a protein A have full length and truncated two
isoforms. The full length isoform shares the same sequence as truncated one.
How could I generate antibody that can only recognize truncated isoform in
flow or immune fluorecent staining. Thanks. |
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H****s
发帖数: 301 | 40 这个问题不是太好回答。
（1）。你这个基因是不是膜蛋白？如果全长蛋白和truncated isoform都是膜蛋白的话
，你的选择是做cDNA免疫大鼠或者是小鼠，然后用细胞表面表达全长蛋白和truncated
isoform的细胞来做筛选。这个过程大概需要3-6个月，看做事的人的效率和运气。
（2）。如果不是膜蛋白，并且你可以表达和纯化这两个蛋白。你的选择有以下两种：
第一种：用truncated isoform免疫大鼠或者是小鼠，然后通过杂交瘤的方法来筛选符
合你要求的抗体。这个抗体很可能识别由于truncation所造成的构象变化。这个过程大
概也需要6个月，看做事的人的效率和运气。
第二种：如果你有资源和人脉，可以使用体外抗体展示的技术（比如，噬菌体展示或者
是酵母展示）。这个应该比较简单一些。这个过程大概需要3个月，看做事的人的效率。
如果你实验室不缺钱的话，就找两个做抗体的CRO，在谈条件的时候说好，拿不到你需
要的抗体不付钱就行了（这招有点损，版上开公司的同学可能会不高兴）。如果我是你
，我会选择这个。因为你可以花时间去做真正的科学研究，而不是把你的时间都浪费在
创造实验条... 阅读全帖 |
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f*******K
发帖数: 34 | 41 从质谱角度来说，有一种可能性，你的蛋白质有没有其他的小分子量的isoform？如果
你的蛋白质不在数据库里面，而是其小分子量的isoform在数据库里面，搜库结果就有
可能只鉴定到小的isoform. |
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m********7
发帖数: 841 | 42 发信人: lummy (河马·云何), 信区: Biology
标 题: Re: 关于将来提高cancer治愈率的一个粗略预期
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jul 19 15:19:28 2012, 美东)
这俩各有侧重，很难互相取代吧。尤其是 NGS 的数据在 accuracy 上还远不能和
microarray 竞争。不说别的，shotgun of RNA 从原理上就使得其测试结果有很大的
bias，使得测 isoform 时不如 isoform array 精确。而 sequencing depth 又直接决
定了 alignment 的可靠性。对于低表达的 RNA，远不如 microarray 更靠谱。
NGS 的作用是 explore for novel transcripts。定量还得 microarray，又便宜又准
。所以我觉得 NGS 的大量使用反而会进一步促进 microassay 的 probe design。
学术界喜新厌旧是常态。但是要想得到靠谱的结果来指导实验和 hypothesis，
microarray 还是 golden standard... 阅读全帖 |
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s*******e
发帖数: 23 | 43 clonist //hehe, take it easy.
generally, RT-pcr is the most sensitive assay to RNA, although sometimes
it cause pseudo positive.
However, RT-PCR can't detect isoforms, or alternative splicing products.
And because of its pseudo positive.
a northern is necessary.
However, S1 mapping of nuclease protection assay is roughly 20 fold more
sensitive than northern. Although these two methods also can't give
you the information of the full length or some isoforms' information.
all in all, these assays a |
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l****0
发帖数: 84 | 44 现已知人体内某一基因有4个isoforms,分别为A，B，C 和D。基因序列均已知。其同源
基因在老鼠体内isoform A，B基因序列已知，C 和D未知。现在的问题是，我想设计
real-time PCR 引物检查Ａ，B,C,D 在老鼠内的表达情况,在C,D 序列未知的情况下该
如何设计引物? |
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m*********7
发帖数: 606 | 45 我认为楼主现在要做的不是如何选择哪个sequence，如何设计primer,而是先确定你现
在使用的组织mRNA或cDNA库里这个蛋白是否有表达，表达的isoform是否如sequence 2
所述，否则的话做的都是无用功。
你首先可以在coding region（最好是两个reporting sequence共有的区域）设计
primer扩增300-500bp的片段。这个片段大小很容易扩增，可以很迅速的告诉你此蛋白
是否在你使用的组织mRNA或cDNA库里有表达，是否可以继续使用该材料进行下一步克隆。
如成功的话，再设计两对primer,分别扩增5'-UTR至coding region, 和coding region
至3'-UTR的片段，同样也是300-500bp,这样可以确认该蛋白是否以你所说的sequence 2
的形式表达。如果是的话，再考虑重新设计primer，PCR条件优化，或者扩增两三个800
-1000bp的片段进行拼接。
如果蛋白coding region有表达，而5'-UTR或3'-UTR的扩增未成功，说明该蛋白是以其
他的isoform存在，你需要做5'-RAC |
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p******i
发帖数: 1092 | 46 我google了一下，貌似有它線粒體的genome...
我現在要pcr一個基因的cDNA，但是它有3個isoforms，如果設計primer針對coding
sequence，3個都有可能被P出來……
而，實踐證明：P出來的是不想要的那個……
我想是不是可以先對UTR做PCR，然後再P coding sequence...
其中的一個isoform有5UTR 和3UTR，但是不知道其他的2個有沒有…… |
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n******7
发帖数: 12463 | 47 学艺不精，一直没搞清楚。如果一个locus上的两个allele，分别是显性的A和隐性的a
，他们在分子水平的对应物是什么？
DNA水平的话，现在用的reference genome sequence是单倍体的（除了chr6等一些区域
），也就是说参考的DNA seq都是一样的。如果两个等位基因DNA sequence不一样，
reference sequence用哪个？
RNA水平的话，那就是isoform了？但是DNA sequence都一样的话，两个allele被调控起
来也是一样的，怎么产生不同isoform来对应不同的表型？这个似乎也不能遗传
其他的还有什么？epigenetics的marker？ |
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j*p
发帖数: 411 | 48 本人在wet lab里面做纯数据分析，for NGS data analysis, 简单介绍一些自己接触过
，并且觉得挺有用的工具，说的有点杂，权作抛砖引玉，还请不吝赐教。
Next-Gen sequencing(NGS)和现在正在发展的3rd-gen sequencing将会在生物学研究中
被越来越广泛应用。不管你信不信，反正我信了。一是基于实验成本的降低（$1k
whole-genome sequencing is coming），越来越多的实验室可以操作；二是可以提供
相对low throughput experiment多的多的数据和信息，可以看到很多从前看不到的东
西；三是sequencer本身对测序的准确性正在逐渐提高，所以实验固有错误率降低；四
是各种算法的成熟应用，这使得很多由于实验产生的误差在出数据后通过对数据的分析
得以过滤。按照library preparation来分，NGS主要有DNA-seq和RNA-seq
DNA-seq is usually used as ChIP-seq to study transcription factor(TF)-DNA
bi... 阅读全帖 |
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j*p
发帖数: 411 | 49 1. 理论上说,只要所研究的基因有足够的reads(最好是pair-end),那么,要确定
splicing isoforms应该不是很难的事情, 可以查询一下两个方法(我虽知道有,但都没
试过): "NSMAP: a method for spliced isoforms identification and
quantification from RNA-Seq", "SpliceTrap: a method to quantify alternative
splicing under single cellular conditions"
2. 假设,比较病人和他父母RNA splicing之后,发现有很多基因存在不同的splicing,这
并不能代表你所说的"和RNA splicing 有关的gene"上面的突变是引起这种疾病的原因,
甚至不能代表这个突变能够用来做为检测这种疾病的marker,因为sample不够.如果你说
的是这种"sample不够,没法做statistics", 那么我以为它不能通过RNA-seq来回避.
sample |
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j*p
发帖数: 411 | 50 本人在wet lab里面做纯数据分析，for NGS data analysis, 简单介绍一些自己接触过
，并且觉得挺有用的工具，说的有点杂，权作抛砖引玉，还请不吝赐教。
Next-Gen sequencing(NGS)和现在正在发展的3rd-gen sequencing将会在生物学研究中
被越来越广泛应用。不管你信不信，反正我信了。一是基于实验成本的降低（$1k
whole-genome sequencing is coming），越来越多的实验室可以操作；二是可以提供
相对low throughput experiment多的多的数据和信息，可以看到很多从前看不到的东
西；三是sequencer本身对测序的准确性正在逐渐提高，所以实验固有错误率降低；四
是各种算法的成熟应用，这使得很多由于实验产生的误差在出数据后通过对数据的分析
得以过滤。按照library preparation来分，NGS主要有DNA-seq和RNA-seq
DNA-seq is usually used as ChIP-seq to study transcription factor(TF)-DNA
bi... 阅读全帖 |
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