m*t
发帖数: 2464 | 1 从加州理工到高盛银行 by 粟耀莹
Why -- California Institute of Technology to Goldman Sachs
Adventure of Alyce Su 粟耀莹
[1] 前言
[2] 19 岁走出台湾赴美
[3] 进入加州理工
[4] 从物理转生物科技
[5] 得到芯片之父 Carver Mead及诺贝尔奖得主 Rudi Marcus的鼓励
[6] 到生物系找指导教授
[7] 我做出了一个经典生物物理模型
[8] 我用分子生物学的方法从事蛋白质工程研究
[9] 蛋白质工程研究成果得奖
[10] 柏波提示我走从商之路
[11] 用蛋白质工程研究成果换取美国绿卡
[12] 蛋白质工程研究成果申请专利，向创投公司融资，开生物科技公司XENCOR
[13] 创办领导加州理工学院的Case Practice Group进军麦肯锡
[14] 麦肯锡McKinsey & Co。梦碎进军华尔街
[15] 一星期内搞懂”衍生性金融商品的圣经”进入PIMCO
[16] 我在PIMCO受的训练
[17] 赢得「债券王」Bill Gross的心
[18] 我买卖房子... 阅读全帖 |
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L******s
发帖数: 2349 | 2 you can find it on Cell.com
http://www.cell.com/content/current#cover_caption
On the cover: Presynaptic plasticity is a fundamental, yet poorly understood
, neural phenomenon that is thought to be the basis of learning and memory.
In this issue, Yao et al. (pp. 943–957) identify a novel ubiquitin ligase n
amed SCRAPPER, which is responsible for tuning of synaptic vesicle release p
robability. SCRAPPER ubiquitinates presynaptic active zone protein RIM1, tri
ggering its proteasomal degradation. Ne |
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k*****n
发帖数: 417 | 3 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: kinston (stone king), 信区: Biology
标 题: 北大一篇Nature Immunology
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Nov 8 11:22:33 2009, 美东)
from生科院蒋争凡实验室。
这位也算是新人，06年回国的，今年已经一篇PNAS，一篇Nature Immunology了。看简
历，也是熬了八年博后才回来的。国内现在也开始飙文章了，裴刚09年已经Cell，
Nature，Nature Immunology各一篇。
http://www.nature.com/ni/journal/vaop/ncurrent/abs/ni.1815.html
Nature Immunology
Published online: 1 November 2009 | doi:10.1038/ni.1815
PCBP2 mediates degradation of the adaptor MAVS via the HECT ubiquitin ligase
AIP4
Fuping Yo |
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s****y
发帖数: 688 | 4 我院2001届本科毕业生余迪以第一作者在2007年的《Nature》上发表了《Roquin
represses autoimmunity by
limiting inducible T-cell co-stimulator messenger RNA》的文章。该文发现了一
条新的防止自身免疫的途径，
即限制T淋巴细胞上一种共刺激因子受体——可诱导型T细胞共刺激因子（ICOS）的表达
水平。
英国著名杂志《Nature》是世界上最早的国际性科技期刊，始终如一地报道和评论
全球科技领域里最重要的突
破。
余迪曾以第三作者的身份在05年《Nature》上发表《A Ring-type ubiquitin
ligase family member
required to repress follicular helper T cells and autoimmunity》。
这两篇论文的意义在于，通过一系列的工作，筛选到一个在自身免疫疾病中发挥重
要调节作用的新基因
Roquin。调节该基因的表达可以成为治疗自身免疫疾病的新途径。
余迪， 1997年考入武汉大学生命科学学院生物学基地班，2001 |
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s****y
发帖数: 688 | 5 发表时间:2009-03-13 10:06
2009年3月12日，免疫学领域权威刊物、Cell杂志子刊Immunity（影响因子19.3）发
表了舒红兵研究组在细胞抗病毒天然免疫领域的最新研究成果，论文题目是“The
ubiquitin ligase RNF5 regulates antiviral responses by mediating degradation
of the adaptor protein MITA”。这是继该研究组2008年9月在Immunity发表论文后
，半年内在该刊物发表的第二篇研究论文。据悉，Immunity杂志自1994年创刊以来，共
发表了3篇由我国完成的工作，其中2篇由舒红兵研究组完成。
天然免疫是细胞和机体天然存在的非特异性或广谱的抗病原微生物的功能，是机体
抵抗病原微生物的第一道防线。抗病毒天然免疫最重要的方式之一是通过I型干扰素（
α/β干扰素）来介导的。病毒感染细胞后，诱导细胞产生具有抗病毒功能的I型干扰素
。2005年，舒红兵研究组及其它三个实验室各自独立地发现了一个在病毒感染诱导I型
干扰素表达的信号传导中不可缺少的蛋白并被分别命名为 |
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r******y
发帖数: 21907 | 6 我的ligation死活不出东西，原来一做就出，现在折腾多次未果，昨天colony PCR除了
带结果质粒酶切后nothing，一定要在节前做出来，生物同修们，有啥建议？我订了新的
ligase，估计是buffer冻容多次就不好了？ |
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g***m
发帖数: 465 | 7 man, refer to gzip's post.
the ligation is somehow vulnerable.
1. check with your lab fellow to make sure your ligase is still alive.
2. always use latest ligation buffer, you can even smell the thio stuff if you
are using NEB enzyme.
3. critical thing is your insert: never directly use the insert purified from
gel, you need gel purification followed by ethanol precipitation to make sure
the purity. However, you can use gel extracted vector for ligation in small
volume.
4. add enough insert, for |
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a***o
发帖数: 129 | 8 Nothing special. Inserts ratio should be 1:1:1. Vector amount around ~50ng.
Inserts the more the better.
I use epicentre's fast-link ligase. I do three-way ligation routinely and
never failed once. Once for a while I do 4-way ligation, sometimes even with a
blunt end:)
stupid. |
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s***e
发帖数: 911 | 9 现在这个问题不平庸了.
以前认为DNA具有线性弯曲弹性. 小于50nm的DNA成环需要的能量太大, 没有外部帮助的
情况下,基本不可能自发成环. 对小DNA链来说, 成环最小需要的弯曲能是:
Eb/KT=2*pi^2*50nm/L. 所以L=150 bp的DNA成换需要至少克服20 KT的energy barrier. 如果
100 bp成环需要克服大概30 KT的energy barrier.
最近西北大学的Widom的lab用T4 ligase作了成环实验. 成环概率大过理论结果up to
10,0000倍.
我们提了一个理论解释, 能很好的解释他们的结果. 就是热激发的连续几个base pair的
melting导致一些local defects. 这些local defects很稀少, 所以对长的DNA不起作用.
对短DNA的极限情况会有很大影响. 严格的理论计算结果果然如此.
Melting机制会使成环概率敏感依赖于温度.另外Melting机制也会影响到DNA的
twist rigidity. 这两个预言最近被Widom的新实验支持了.
所以我现在的看法是: 多小的DNA都能 |
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d*****r
发帖数: 2583 | 10 ☆─────────────────────────────────────☆
Genemo (猜猜) 于 (Tue Feb 17 12:37:29 2009) 提到:
整个目标是把2个3.4kb的片段连在一个8kb的载体上
现在第一个已经连上去 是双酶切的
第二个怎么也连不上去了
这个是单酶切 为了避免过多污染 我直接PCR产物酶切 酶切位点旁边留了4个碱基给酶
bind
虽然PCR的模板是质粒 但我做了割胶回收
现在insert自连很多 和正常的连接差不多 很奇怪为什么自连了还能有抗性呢
这个问题不知道有么有高人见过而且解决过？
还有就是现在这个载体太大了 怎么才能提高连接效率呢
☆─────────────────────────────────────☆
albertsmwk (Stay in Bio) 于 (Tue Feb 17 12:52:48 2009) 提到:
载体用SAP处理，过夜酶切，过夜SAP，基本可以做到没有自连
insert自连。。。。你为啥知道啊？！难不成跑胶测序？
不行用takara的long ligase kit，做10K肯定没问题 |
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y******y
发帖数: 107 | 11 目的基因4.8kb, plasmid A 4.7kb。 ligation是用的pGEM－T easy vector的用来测序
的ligation方法，具体是
目的基因 150ng
plasmid A 50ng
T4 DNA ligase 1ul
2xbuffer 5ul
Total volume 10ul,
4C for 16h, 取2ul transformation。 |
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k******g
发帖数: 38 | 12 这个一作是一个人,一期science,2篇research article
Identification of SCF ubiquitin ligase substrates by global protein
stability profiling.
Yen HC, Elledge SJ.
Science. 2008 Nov 7;322(5903):923-9.PMID: 18988848 [PubMed - indexed for
MEDLINE]Related articlesFree article
Global protein stability profiling in mammalian cells.
Yen HC, Xu Q, Chou DM, Zhao Z, Elledge SJ.
Science. 2008 Nov 7;322(5903):918-23. |
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h*********9
发帖数: 361 | 13 版上时不时就有人上来问克隆问题，我就简单说一下个人的一点点经验：
克隆的第一步一般都是从PCR开始的。PCR关键是引物设计。推荐用免费的primer3。手
动设计注意引物一般GC含量45%-55%。长度在20-24之间。3'端最好不要有很多GC在一起
（40%即可）,以减少非特异产物。内切酶位点一般加在引物的5'端，最好有4-6个以上
保护碱基以利酶切（很多酶对此有硬性要求，详情参见NEB目录）。设计好的引物可以
到www.idtdna.com察看二级结构等引物信息。
第二步酶切（当然也可用TA克隆法）很关键，一定要酶切彻底才会有较高的连接效率，
我的经验是对大多数质粒，一个微克用NEB的酶1微升（10-20 U）/3-4小时，50微升体
系。PCR产物酶量要适度增加因为长度短末端多。难切的酶可酌量延长时间或加大酶量(
难不难切可参见NEB每个酶后面的说明：After a XXX-fold overdigestion with XhoI,
> 95% of the DNA fragments can be ligated with T4 DNA Ligase (at a 5'
term |
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n********k
发帖数: 2818 | 14 I recall is to both promote the completion of ligation and meanwhile to kill
the ligase... |
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D****s
发帖数: 5 | 15 此蛋白是一个ubiquitin E3 ligase. 加了蛋白酶抑制剂并且是低温操作，还是绝大部
分蛋白被降解。感觉降解应该发生在收菌以前。我需要表达纯化全长的此蛋白。
请问这种情况，换一个E.coli host strain 来表达会有效果吗？ |
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t******r
发帖数: 8600 | 16 Invitrogen has some good stuff, like Topo, etc. But, most of its products
have very poor quality, I guess they
are getting too big and there are tons of garbage startups sequeeze their
poor products onto their shelf.
BAD!!!
The bad stuff I have used recently:
Stbl2 & 6
DNA ligase
Cre recombinase
RE enzymes
...
...
For cloning, NEB products are the most reliable. |
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s****l
发帖数: 395 | 17 好怀念国内的Takara，价格便宜量又足
还有华美的T4 DNA ligase，价格是promega的1/8，效果非常的好 |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 Thanks! I will give them a try later.
Are they using the oligo-dT system or the 5'-end RNA ligase?
Is it possible to do a 5-RACE with Fermentas' kit? |
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s****a
发帖数: 436 | 19 最近做DNA ligation. 请问大家，DTT在T4 ligation 中的作用是什么？查了资料，DNA
ligation中主要起作用的是ATP 和 Mg2+. DTT是不是起到保护ATP，防止其被氧化的
？请问有专门的文献介绍DTT的作用么？Thanks. |
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a******e
发帖数: 119 | 21 我在用Taq DNA ligase将两个富含GC的约70bp的单链DNA片段连接。 直接连，没连上。
又95度加热10分钟，cool down overnight，再连接，还是没连上。 请教各位有什么建
议么？
另外如果把单链变为双链后再连接，怎么由双链的DNA在获得单链。 Thanks |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 FT! FT! FT!
Of course you cannot ligate the single strand DNA like this way! Because
there is NOTHING to hold these two fragments together to allow the ligase to
act.
If you really want to ligate the single strand DNA, at least you should use
some kind of carrier system like BSA or other stuffs like a non-specific DNA
-binding protein.
If you choose to ligate from the double strand DNA, you can of course break
it down to single strand by incubating them on high temperature with
denaturing reagen |
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n******d
发帖数: 680 | 23 合成末端磷酸化的互补oligo，然后在TE中变性复性，用T4 ligase连接，oligo记得过
量加
长出来的clone基本都是，不过最好在合成的oligo中设好合适的酶切位点
章也 |
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b******k
发帖数: 1874 | 24 so, if i am going to ligate two tandem short fragments (say, 50bp each):
synthesize 50nt oligo of Sense and antisense (with 5' phosphate group modifi
cation),
anneal them by boiling and cooling naturally,
then ligate the annealed fragments (ideally, with synthesizd 3' overhang fro
m first one, and 5' overhang from 2nd)by conventional T4 ligase system?
thanks. |
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s********n
发帖数: 2939 | 25 设计oligo的时候可以把粘性末端设计好，链接前可以不用做酶切。
我试过的一个protocol，非常简单好用：
1. oligos用TE or H2O溶解，浓度100 uM；
2. 磷酸化准备如下，37C一个小时, 70C for 10 min.
15 ul H2O + 2 ul oligo (100 uM) + 2 ul T4 ligase buffer + 1 ul TNK
3. 退火反应如下，95C 5 min in PCR cycler，RT for 30 min.
18 ul H2O + 1 ul oligo F + 1 ul oligo R (final 0.5 uM fragment)
这个产物可以直接用于连接。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 只做过3'的RACE,原核,所以要用adaptor
做得是RNA-ligase-mediated-3'-RACE |
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b******e
发帖数: 61 | 27 多谢楼上的回复。
因为我的目的是想把4kb片断弄到pLenti7.3里边去，没有合适的酶切位点，只好用TA
cloning. 我也试过不用kit里边带的topo, 自己用T4 Ligase做TA连接，也失败了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 DNA are double helix
On the vector part there will be one 5'-end and one 3'-end on each side.
If only one end has the phosphate group, it will be enough for the ligation
to work. The nicked end can be patched up later inside the bacteria.
In some case, in order to increase the efficiency of transformation, people
use T4 ligase to put the phosphate group on the two 5'-ends of the oligo. I
think this is why your senior in the lab ask you to do that. In this case,
you should follow his/her directio |
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m******e
发帖数: 18 | 29 MultiSite Gateway® Pro Plus (for flexible cloning of up to four DNA
fragments into a Gateway® Destination vector) from Invitrogen, you can
clone multiple DNA fragments into one vector without using restriction
enzymes or ligases. |
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a****o
发帖数: 1786 | 30 dePi ur oligo
order a 5'P oligo A w/ known sequence
ligate w/ RNA ligase
use reverse complement oligo of A to do primer extension to get double
strand DNA
clone into T-vector or blunt end vector |
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor（DNA)到RNA的3'端，
然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
5'RACE也可以用这个方法做
我试过这个方法的3' RACE，还蛮方便的
因为我做的原核，没有poly-A tail，没有kit可以用
这个方法帮了我大忙
“5 |
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R*****w
发帖数: 447 | 32 你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
我这个方法是我当时自己想到的，但我一直没发表，后来博士毕业了不做测序工作了，也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。 |
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R*****w
发帖数: 447 | 33 其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
太有效 |
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p****p
发帖数: 3360 | 34 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？ |
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p****p
发帖数: 3360 | 35 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 36 用RNA ligase的那个不是在合成cDNA以后加tail
是mRNA直接加tail
然后再RT-PCR
再加tail
更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
，也没想过去发
表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。 |
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s*********s
发帖数: 110 | 37 Jiang Xuejun
E3 ligase for PTEN
ce |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 Hmmm. You do have a very interesting point.
For a globular protein or a protein with a good scafold that won't fall
apart by being cut, such a scenario is actually possible...(even though not very likely)
The other concern is, is there any protein ligase at all? |
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s********n
发帖数: 2939 | 39 有artificial peptide ligase，但效率很低，1E4。 |
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m*********7
发帖数: 111 | 40 pBluescript SK+ 用BamHI 完全单酶切后,得到的线性DNA片断(约3.0kb，没有用去磷酸
酶处理)用Qiaquick PCR purification kit纯化，纯化后的线性DNA保存在水里，在没
有DNA ligase的情况下，该DNA片断稳定么?会不会自连成环呢?
请大拿们不吝赐教，3x in advance! |
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o********r
发帖数: 775 | 41 十年前俺做过这事（17Kb的plasmid），而且过程和你说的很象，最后筛了5个月（每天
就是早上抽质粒，下午PCR/跑胶，然后ligation/transformation，回家前pick colony
/incubation O/N），前后尝试了无数种ligase/competent cell，几乎市面上相关产品
都试了个遍，终于找到一个要的clone。其实17Kb对于某些质粒而言已经差不多是上限
，不稳定，体内很容易发生重组，如果可能尝试不同的vector，或者不同的competent
cell/transformation protocol。另外你或许可以试试Ca++ based
transformation。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 42 不知道呀。怎么样可以知道ligation等是否成功呢？我RE cut了以后跑胶然后切胶再提
取DNA再做transformation的。ligase几个月前用都是好的，现在应该也没问题吧？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 43 What an AMAZING woman! seriously!! I vote her to be a next Nobel laureate
and a first Chinese and it is a girl too....
http://english.cas.cn/accessory/twows4th/twowsaward/201006/t20100627_55793.html
Professor Fanyi Zeng was born in 1968. She received her B.A. in University
of California San Diego, CA, USA in 1991. In 2005, she got her Ph.D in
University of Pennsylvania, PA, USA.
Professor Zeng has led a research team that has made substantial and long-
lasting contributions to the developmental ... 阅读全帖 |
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v***a
发帖数: 1242 | 44 前几次一直长不出colony，换了一个ligase，这次transformation后平板上长得满满趴
趴。同时也用了一个uncut的vector做+ve ctrl，长得比有insert的还要满。
很高兴。挑了18个colony做PCR check，结果出来傻眼了，什么都没有，光marker那一
条lane亮的。大家觉得这是怎么回事啊？多谢多谢！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 45 有，叫splinted ligation。
因为T4 DNA ligase的功能是特异性修复双链DNA上的nick。所以需要设计一个splint
oligo，和你需要ligate的两个oligo的两端各自互补。像这样：
图里显示的是连接RNA，不过DNA也是一样的。
这个protocol在这里：
http://www.megaupload.com/?d=QT50D23R
[7] Joining of RNAs by splinted ligation
Melissa J. Moore and Charles C. Query
Methods in Enzymology
Volume 317, 2000, Pages 109-123
RNA - Ligand Interactions, Part A |
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r******y
发帖数: 21907 | 46 我的ligation死活不出东西，原来一做就出，现在折腾多次未果，昨天colony PCR出了
带结果质粒酶切后nothing，一定要在节前做出来，生物同修们，有啥建议？我订了新的
ligase，估计是buffer冻容多次就不好了？ |
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a****k
发帖数: 1130 | 47 T4 RNA ligase with 32pCp? |
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d*****r
发帖数: 2583 | 48 大家不要吵了，读读这篇老帖子，娱乐一下。。
我第一次读到是刚来美国不久，今天偶然又翻到，觉得peoplem的这个校友
(Alyce Su)还是很有趣的，虽然里面很多东西跟今天的世界已经差别很大了。
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jsj 贴于2004/07/25 12:12
《从加州理工到高盛银行》 -- 粟耀莹
Why -- California Institute of Technology to Goldman Sachs
Adventure of Alyce Su
CalTech，PIMCO，McKinsey，Goldman Sachs
so that I get to see Larry Ellison !!!!!
[1] 前言
[2] 19 岁走出台湾赴美
[3] 进入加州理工
[4] 从物理转生物科技
[5] 得到芯片之父 Carver Mead及诺贝尔奖得主 Rudi Marcus的鼓励
[6] 到生物系找指导教授
[7] 我做出了一个经典生物物理模型
[8] 我用... 阅读全帖 |
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l****o
发帖数: 442 | 49 正在研究某个分子的E3 ligase活性，在enzo boston公司订了个Auto-
ubiquitinylation kit 做了几次阳性对照都没有出来，我个人觉得是试剂盒有问题，
但是因为第一次做，没有概念。
不知道哪位版友做过这方面的实验，是不是很难做。
如果有可能请推荐一个好用的试剂盒。
谢谢！ |
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H****s
发帖数: 301 | 50 It is much more friendly to T4 DNA ligase. |
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