D*a
发帖数: 6830 | 1 提供2篇references
Cre-mediated germline mosaicism: a new transgenic mouse for the selective
removal of residual markers from tri-lox conditional alleles.
Leneuve P, Colnot S, Hamard G, Francis F, Niwa-Kawakita M, Giovannini M,
Holzenberger M.
Nucleic Acids Res. 2003 Mar 1;31(5):e21.
36.
Cre-mediated germline mosaicism: a method allowing rapid generation of
several alleles of a target gene.
Holzenberger M, Lenzner C, Leneuve P, Zaoui R, Hamard G, Vaulont S, Bouc YL.
Nucleic Acids Res. 2000 Nov 1;28( |
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p*******r
发帖数: 4048 | 2 Why not just make a lox mouse. |
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O******e
发帖数: 4845 | 6 是啊，就是一技术升级版。
我觉得rat knockout其实意义也挺大－－就是一样得不了炸药奖。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 7 过几天猕猴的KO呢？这种不是炸药奖的口味吧，没啥本质突破 |
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i***i
发帖数: 33 | 10 Could anyone please send me the following paper to my email address:
m******[email protected]
Guan S, Wang B, Li W, Guan J, Fang X. Effects of berberine on expression of
LOX-1 and SR-BI in human
macrophage-derived foam cells induced by ox-LDL. Am J Chin Med. 2010;38(6):
1161-9.
Many many thanks! |
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l*******1
发帖数: 128 | 12 I think it's the pUNI system, using Cre-lox to fuse plasmids.
法" |
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l***y
发帖数: 4671 | 13 啊。。。我们是不是说岔了。。。我是说转进去三种不同不同颜色的 fluorescent
protein，用
cre-lox recombination 来实现三色不同的比例，使得每个细胞的颜色都不相同的那个
。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 对于细胞，没有必要用cre-lox 啦，那个是在在体情况下没有办法才作的啦。
对于细胞来说，因为不同的细胞可以分开转染，然后再混在一起就是了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 我们也有类似经历，不过幸运的是我们转进去的只是一个单独的GFP
reporter, 看不到就拉倒了，反正有其他方法来知道哪个是transgenic老鼠.
我们的感觉是很多转进了老鼠内部的基因会有可能被体内的机构关起来不让
表达，或者表达大大降低。
你的情况，最好是这样：
１。把组织提出来做western blot
2. 用anti-GFP 来加强荧光。
我们一向都用Roche mouse anti-GFP，他家的抗体stock solution稀释得比较高，所以
用的时候不能稀释太多(所以比较不经用），但是特异性比较高。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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f***4
发帖数: 886 | 17 这个很正常的。
检查一下你的TARGET载体构建和ROSA-YFP是不是一样，就是说整合在ROSA的位点是不是
一样。
现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同意就是整
合的位点不一样。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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n********k
发帖数: 2818 | 18 also fusion-GFP sucks most of time...
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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l*********i
发帖数: 332 | 19 how in vitro experiments are done exactly? details.
what kind of cell, what exactly construct have you used?
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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i*********0
发帖数: 915 | 20 in vitro 可以.
不过听说也有人直接把restriction enzyme放到细胞里面去切DNA的,因此,你的问题理
论上也可以.
不过效率高不高就不知道了. |
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l******g
发帖数: 1623 | 21 你说加Cre 酶吗, 这个很难进2层膜跑到核里面去, 还能保持活性吧. 应该作
transduction. |
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J********3
发帖数: 3151 | 22 Ad-Cre（腺病毒Cre）加到培养基里，效果还可以 |
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h***a
发帖数: 145 | 26 thinking about the same thing... |
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s********s
发帖数: 67 | 27 弄个表达cre的质粒transfection 就行 |
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y****u
发帖数: 74 | 28 各位老大，用loxP老鼠交配RosaCreERT2，然后分离细胞体外4-hydroxytamoxifen如何
？ |
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m*****u
发帖数: 15526 | 29 可以。不过太费劲和花时间。用permeable cre peptide做短平快实验完全没问题。但
最好用cre报告基因比如YFP，好知道作用效率 |
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f*******a
发帖数: 671 | 30 哈哈,我也正打算做相似的试验,培养loxp元代细胞再转表达cre的lentivirus |
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D*a
发帖数: 6830 | 31 这个不是我老板的方向。
我倒是想做screen啊，我觉得我老板的几个课题上rna seq还是挺有做头的，但是可惜
我没有计算机背景，再说我毕业就闪人了，又不能一直在同一个实验室里面做，老板要
是能招个有计算机背景的人来做，我倒是挺看好。
我们就做一种protein和与其相关的一种通路而已，用cre lox。 |
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l********s
发帖数: 70 | 32 tamoxifen 用来做条件性敲出的。谢谢各位大侠啊！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 Please try NYU Sun-lab free protocol links:
a)
//webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-
lab/attachments/CPSC.Ch5.Genetic%20Manipulation%20of%20Stem%20Cells.pdf
b)
//webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPCB.ch19.Tissue%20Analysis.pdf
c)
//webdoc.nyumc.org/nyumc/files/sun-lab/attachments/CPMB.Ch.29.MousePhenotyping.pdf
plus alfa
//biology.hunter.cuny.edu/molecularbio/Class%20Materials%20Spring%202011%20BIol302/Lecture%2023/I
nducible%20Cre.pdf
and beta
//biologie.univ-mrs.fr/upload/p102/Kw... 阅读全帖 |
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S******9
发帖数: 2837 | 34 你是成鼠做还是D1，还是妊娠母鼠？
这个很容易，不要跪求，说说条件吧 |
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z****u
发帖数: 1007 | 35 Tamoxifen拿corn oil 配成20mg/ml 浓度。然后每天给成鼠注射4mg IP. 成鼠对此表示
无压力。情绪稳定。有的protocol还拿酒精稀释。我的经验是那样经常会把老鼠打死。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 36 Tamoxifen拿corn oil 配成20mg/ml 浓度。然后每天给成鼠注射4mg IP. 成鼠对此表
示无压力。情绪稳定。
How many days can you inject without killing them? how old are the mice? i
am trying to get your dosing(ours are at between 150mg-180mg/kg)
有的protocol还拿酒精稀释。我的经验是那样经常会把老鼠打死。
Yes, with this one, at our dose, the mice feel the stress after 3 days and
cannot tolerate more than 6 days...lethality could be up to 20-30% with 6-7
doses... |
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S******9
发帖数: 2837 | 37 我是那ethol溶解，然后sunflower oil稀释10倍。
每天是1mg， 连续10天。老鼠在3-4天有点精神不是很好。
如果是3mg/d。老鼠在3天以后很容易死。
1mg/d x 5天我们的target基因deletion大概是90-93%， 如果是10天就可以到97-99%之
间。 |
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l********s
发帖数: 70 | 38 谢谢大侠！！！ 好人有好报！
20Analysis.pdf
MousePhenotyping.pdf
20BIol302/Lecture%2023/I |
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l********s
发帖数: 70 | 39 先做成鼠，实验室买的是 tamoxifen-citrate 注射的。估计这个只能feed，不能注射
谢过这位大哥了！ |
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l********s
发帖数: 70 | 40 非常有用！，谢谢，我看很多是酒精稀释的。 我们暂买的是 tamoxifen-citrate
非常感谢您！
7 |
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l********s
发帖数: 70 | 41 谢谢您！，
我也想做primary cell的，最近老板催的紧。非常有用，收下啦！ |
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l********s
发帖数: 70 | 42 我想把 tamoxifen-citrate 溶解在水中，给老鼠
tramoxifen-citrate 经过stomach 后，可以分解成citrate 和tamoxifen-free base。
不过剂量还没找到，呵呵，打算用食物比例算算，您有什么建议吗？ |
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z****u
发帖数: 1007 | 43 我就是拿Sigma的corn oil 20mg/ml就是最大溶解度了。 37度下溶解。然后冻存。剂量
4mg/30g ..差不多就是150mg/kg. 老鼠年龄3周以上。 一般打2-4天。看Cre的效率了。
有的cre很好，一天就够。想要保证高效的就打4天。so far还不错。没打过超过4天的
还。
酒精稀释感觉坏处很大。 一来把tamoxifen稀释了，注射volume得提高，再来酒精打到
腹膜下反应很大，有好些老鼠甚至当场死亡。
7 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 De rien.
plus
Bouvier J and Cheng JG.
Recombineering-based procedure for creating Cre/loxP conditional knockouts
in the mouse. (2009)
Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23:Unit 23.13.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19170029 |
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S******9
发帖数: 2837 | 45 这个我也做过，灌胃，每天是3mg，连续5天。这个deletion效果一样。
不能加到水里喂，效果不好。
有那种和食物做到一起的，但是好像很贵，我老板以前舍不得出钱，看见有一个实验室喂含在食物
里面的，每天是1mg，喂42天，我们没买这个食物，结果我给老鼠灌胃了42天，最后还是效果不
好，最后发现是那个Cre的老鼠不work。
base。 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 46 搭车问：
Topical application真的能只在涂抹的地方敲除吗？
有的说可以，效果很好；有的说这种情况tamoxifen需要转运到肝脏代谢然后分布全身
，其实跟IP的效果差不多。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 47 你要是想马上做，可以试试high-fat diet–induced insulin resistance或者ob/ob的
老鼠吧，都是比较简单的protocol。
这些的坏处就是不是肌肉专一的，但是如果是搞cre lox的话交配就要两三代，如果
inducible还加上打针，不知道你是不是想等啊。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 48 没有百分百的敲除，KO条带很淡(这个跟western显色也有点关系)就可以了，能达到80%
以上就算是比较好的。个人看法。 |
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K**R
发帖数: 193 | 49 最近开始做一个基因敲出对fetal stage 影响。 比如我拿到怀孕母鼠，开始注射。我
现在不知道从那个时间点注射，是开始怀孕第0天就注射母鼠，还是我研究的组织开始
发育时候注射？
还有个问题题 我看tamoxifen大家注射一般都是连续5天，如果我从组织开始发育注射
是不是会造成敲出不明显缺点？ |
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s*****d
发帖数: 2451 | 50 这个得小心，弄不好tamoxifen剂量大了就会造成流产，小了又不管用，得多试。 |
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