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Z****9
发帖数: 738 | 2 为什么mCherry不行呢
GFP和mCherry在小鼠和斑马鱼里面用得很广呀 |
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Z****9
发帖数: 738 | 4 为什么mCherry不行呢
GFP和mCherry在小鼠和斑马鱼里面用得很广呀 |
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h******y
发帖数: 1374 | 5 有人用过GFP或者mCherry标记的LC3来观测autophagy吗？
能不能用FACS来检测autophagy |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 是的，mCherry是DsRED衍生出来， 但是有的地方被修改过所以和eGFP 有相似性。
DsRED |
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p******b
发帖数: 379 | 7 搭车问个问题，
现在想构建一个质粒， 在不同promoter下面分别表达两个荧光蛋白， 然后做
transgenic 老鼠，需要考虑组织自发荧光， 并且可能需要用抗体做染色之类的， 所
以需要目前市面上有好抗体的荧光蛋白， 请问选什么荧光比较好？ eGFP和mCherry可
以吗？
THANKS |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 这个问题以前有人说过，最好是YFP, 以及某个红色荧光蛋白（我忘记名字了，
但是肯定不是mCherry, 而是某种TomatoFP) |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 是的，mCherry是DsRED衍生出来， 但是有的地方被修改过所以和eGFP 有相似性。
DsRED |
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p******b
发帖数: 379 | 10 搭车问个问题，
现在想构建一个质粒， 在不同promoter下面分别表达两个荧光蛋白， 然后做
transgenic 老鼠，需要考虑组织自发荧光， 并且可能需要用抗体做染色之类的， 所
以需要目前市面上有好抗体的荧光蛋白， 请问选什么荧光比较好？ eGFP和mCherry可
以吗？
THANKS |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 这个问题以前有人说过，最好是YFP, 以及某个红色荧光蛋白（我忘记名字了，
但是肯定不是mCherry, 而是某种TomatoFP) |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 在斑马鱼里我不知道，在老鼠里面我们的经验是，无论是GFP or mCherry,
除非只表达荧光蛋白本身，如果是fusion 的话，表达之后常常看不见荧光，
除非后来用抗体来定位，但是这样就失去了用荧光蛋白的意义了。 |
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b**********s
发帖数: 435 | 13 含有GFP，mCherry，Tomato的转基因老鼠
在什么波长的光源下，或者能不能看到发光？
虽然不一定能表达，只是想在做genotyping之前，想有个概念。 |
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l****y
发帖数: 398 | 14 我们做了一批anti-GFP和anti-mCherry的nanobody(15 KDa, single-domain antibody)
, 有两个用来做affinity purification/immunocapture很好用。
有需要的同学请通过站内信提供一个US non-profit research institute 的地址.
vector用e.coli 表达，periplasm加Ni-NTA纯化，一般可以拿到2mg/liter culture.
质量比多抗稳定，成本也低。适合需要做很多affinity purification的情况。 |
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V******t
发帖数: 444 | 15 估计不同的细胞系不一样。但是泛泛而言，如果关闭一个mCherry报告基因的表达，多
久能看到变化？24小时够不够？
有人有这方面的经验吗？
谢谢！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 16 不明mCherry
不过可以参考Rosa-mTmG被Cre切割后的情况？ |
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V******t
发帖数: 444 | 17 估计不同的细胞系不一样。但是泛泛而言，如果关闭一个mCherry报告基因的表达，多
久能看到变化？24小时够不够？
有人有这方面的经验吗？
谢谢！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 不明mCherry
不过可以参考Rosa-mTmG被Cre切割后的情况？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 如果你需要区分GFP and mCherry 的话，Clontech的最好使。
如果不需要区分的话，随便找一个公司都行。 |
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p******b
发帖数: 379 | 20 大家好， 我想做一个双荧光reporter老鼠， 打算构建一个全身表达EGFP和mCherry的
reporter老鼠， 其中mCherry受某个miRNA调控， EGFP不受miRNA调控（作为control）
，因为miRNA结合可能导致mRNA降解， 所以我想把EGFP和mCherry分别表达在不同的
mRNA上面， 请问这样设计可行吗？ pUBC-EGFP-PolyA-pCAG-mCherry-miRNA binding
site-PolyA
谢谢了，请多指教 |
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V******t
发帖数: 444 | 21 CMV promoter 在mESCs里面会沉默，对吧，比如mE14、J1，用CMV驱动表达是不行的。
但是我想用minimal MCMV promoter，前面接一个multimerized DNA binding sites，
后面表达mCherry，在ES细胞表达能结合DNA的转录因子，看mCherry。这个会有问题吗
？我的载体将会是
-DNA binding sites-minimal MCMV promoter-mCherry-PGK-puro-
如果不行。pGL4载体是用minimal Promoter，驱动luciferase，想问这个minimal
Promoter是啥？能用在mE14吗？可以用GFP换掉后面的luciferase吗，有这样的载体可
以分享／买的吗？最后得到一个这样萌萌哒的载体：
- DNA binding sites - minimal Promoter - mCherry - SV40 early enhancer/
promoter- hygro -
这个用在mE4没问题吧？
谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 你太想当然了。
比方说我们做实验的人，每天会产生几百个文件，我们会把他们都放在同一个用时间做
标题的folder 里面，但是实验文件本身的名字很长而且相近。比方说
XXX-test-YYYrescue-GFP-1s-mCherry-500ms-63x-oil-09-12-14-001.tif
XXX-test-YYYrescue-GFP-1s-mCherry-500ms-63x-oil-09-12-14-002.tif
XXX-test-YYYrescue-GFP-1s-mCherry-500ms-63x-oil-09-12-14-003.tif
。。。
如果用folder法，那么每打开一个folder就只看那一天的文件。方便于我们进行对比和
分析。
如果用搜寻法，会导致一下出来几千个名字几乎一样的文件，但是很多是混合在不同日
期的，那么我们还必须对日期进行分类，会让我们多出很多本来没有必要的工作量。
而且，万一我去看学生的记录的话，现在的方式我不需要知道他们怎么对文件命名，我
只要进入他们的folder就知道他们哪天干了啥了。如果需要我搜寻，我还必须知道搜什
么才行。 |
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T**********r
发帖数: 287 | 23 设计以adenovirus为载体，以CMV为promoter,drive mCherry和shRNAmir,shRNAmir从
openbiosystem pGIPz上PCR下来，连接到载体上，即pAd/CMV/mcherry-linker-
shRNAmir,
计划用adenovirus侵染免疫缺陷的rag1-/-animal,不知道这样设计合理吗？
另外可以直接用以lentivirus为载体的shRNAmir做in vivo的knock down吗？
多谢了！ |
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b******s
发帖数: 1089 | 24 如果你使用的是一般的laser scanning confocal的话，根据laser source的不同，有
几种固定波长的laser，可以选择。即使不是正好在所谓的maximum上，前后一定范围内
的也是很好用的。488nm既可以激发GFP，也可以很好的激发YFP。你可以设置搜集的
emission的波长，尤其是有两种颜色的荧光的时候。
mRFP和mCherry等都是从最早的DsRed改造过来的。m代表他们大多是单体（我印象里是
这样的），因为dsRed很容易形成四聚体。但是经过改造之后，excitation和emission
都有所变化。但是基本上580nm/610nm都可以很好用。mCherry荧光强度最高，但是mRFP
也很不错。
怎么查？google就可以了。虽然mRFP有很多突变体，Q66M或者是你的Q66T等，主要是促
进了蛋白折叠成熟，用580nm/610nm应该没问题。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 25 对于荧光蛋白来说，如果要做fusion，最值得考虑的是三点
1）颜色
2）发光形式是多聚还是单体。最好是单体，比如EGFP，AcGFP, mCherry，mStrawberry。
DsRed，ZsGreen等等都是臭名昭著的tetramer，做了fusion之后经常一个皿中没几个发
光的，这种发光的细胞往往对于研究是无效的（这种定位不可靠）
3）relative brightness。如果以EGFP为100，那么GFP(48)，AcGFP(82),mCherry(47)
mStrawberry(78), DsRed(176),DsRed-Express T1(58)，DsRed-Monomer(10),Zsgreen(
117)
相对而言，别的参数大部分都是浮云
如果不做fusion，尽可以选择那些相对发光强度大的比如DsRed,Zsgreen |
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p******b
发帖数: 379 | 26 谢谢大家了， 这么热情的帮忙，
关于promoter， 大家认为是用同一种promoter， 还是两个不同的promoter好呢？
我目前倾向于两个不同的promoter （UBC 和CAG）分别表达GFP和mCHERRY, 但是如果用
同一种promoter的话，GFP和mCHERRY的表达水平会更接近，更利于比较，不过听说用同
一种promoter的话，质粒本身会有重组， 所以很纠结是用同一promoter还是两个
promoter
还有关于polyA的，也是相同的问题， 是不是得用两个不同的polyA会好一些呢？
真心感谢! |
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m*****p
发帖数: 8 | 27 以我有限的智商判断这大概是在说我的文章。本来不想回的，可是记得几天前的一个帖
子似乎也提到了类似的事情。
关于那片文章，不管gfp还是mcherry结论是一样的。唯一的区别是mcherry可能引起的
dimmer或者其他的原因会引起synapse位置蛋白增多。在gfp的情况下大部分蛋白在细胞
核或核附近，小部分在synaspe和axon。
另外我只知道有一个postdoc。和一个研究生在做继续的课题 （一个很漂亮的韩国姐姐
，和很漂亮的美国妹妹。）。 关于这些试验的细节我在组会上已经说的很清楚了。我
跟韩国姐姐一起做了一些试验，她有一些新的发现，是在原有的现象上有一些新的发现
，具体是什么就不说了。。。那个研究生的课题，据我所知很顺利。
可能因为我是神经所毕业的，大概这也是为什么会被在这个帖子里提起。所以我还要废
话几句。
关于poo。 从我个人来说，我非常感谢poo。我记得我还是研究生的时候，poo参加了我
们几乎所有人的每一次的年度审核，给我们专门讲解如何读论文和写论文，几乎帮助所
有人做过一对一的几乎逐字逐句的改写manscript。我还没有到可以评价poo对科学界或
中国科学贡... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 42 | 28 靠，本意是讨论ethnics，乱枪射出的”房妹“来
就事论事，在老poo的严谨下，你这data能是一样的吗？
》》
关于那片文章，不管gfp还是mcherry结论是一样的。唯一的区别是mcherry可能引起的
dimmer或者其他的原因会引起synapse位置蛋白增多。在gfp的情况下大部分蛋白在细胞
核或核附近，小部分在synaspe和axon。
》》
这个pattern 都shift了八？姐，不带这样的？
你包老poo和老jin的大腿，夸他们严谨，就是为了反衬你自己。可你这也太离谱了？ |
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f***y
发帖数: 4447 | 29 http://pkunews.pku.edu.cn/xxfz/2018-04/17/content_302026.htm
北京大学分子医学研究所陈良怡团队联合华中科技大学谭山团队发明了一种超灵敏结构
光超高分辨率显微镜——海森结构光显微镜（Hessian SIM)。此项成果近日以全文形式
在线发表于Nature Biotechnology (影响因子41.67)，论文题目为“Fast, long-term,
super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy”。
在每秒钟得到188张超高分辨率图像时，海森结构光显微镜的空间分辨率可以达到85纳
米，能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构，而所需要的光照度小于常用的共聚焦
显微镜光照度三个数量级。由于极低的光漂白以及光毒性，实现了100 Hz超高分辨率成
像下连续采样10分钟得到18万张超高分辨率图像，或者是在1Hz超高分辨率成像下连续1
小时超高分辨率成像基本无光漂白。
与获得2014年诺贝尔化学奖的受激辐射损耗超高分辨率显微镜（ST... 阅读全帖 |
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b****d
发帖数: 4648 | 30 make you mcherry beijing? hoho |
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G*********o
发帖数: 49669 | 31 好吃嘛
make you mcherry beijing? hoho |
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f*****r
发帖数: 84 | 32 第一次用荧光蛋白定位（mcherry), 但显微镜镜底下一下就photobleach了，用什么办
法可以延长fluorescent的时间，什么fading media比较好呢？ thanks! |
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s*******g
发帖数: 3332 | 33 我记得好像有LC3-GFP transgenic mice
不是做这个的，不是很清楚具体细节，但是印象中听过报告 |
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s*********r
发帖数: 13 | 34 第一次设计fusion protein,想给自己的蛋白加个mcherry tag,没有现成的载体，不知
道中间需要加个linker呢，还是直接按ORF接上就好呢？pcDNA3.1的vector。没有现成
的linker给我用，如果要加的话，是不是得设计到primer上去，那这primer也太长了吧
，能P出来吗。。。。
谢谢指导^^ |
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T**********r
发帖数: 287 | 35 现在正在用invitrogen的viralpower adenoviral expression system, infect 293a
cell, 在37度培养箱培养。
箱内一层共有16个15cm plate,其中十个是infected的，其它6个是未被侵染的，用来
split
cell的。3天后发现所有的plate都被侵染了，都表达了mCherry.
可以肯定的一点绝不可能是我不小心将virus加到其它6个plate里了。会不会virus自
己挥发出来
侵染了其它盘，如果这样，应该怎样防护。希望大家分析一下，感激不尽！ |
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T**********r
发帖数: 287 | 36
我是往pancreas里注射，让adenovirus侵染pancreas，并且在pancreas里表达，这个技
术问题已
经解决了。我是想知道pAd/CMV/mCherry-linker-shRNAmir这样的设计是否合理。
linker是
polycistronic的2A。多谢答复。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 37 楼上正解，你需要dual promoter vector. CMV drives mCherry and H1 drives shRNA
expression separately |
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h******y
发帖数: 1374 | 38 Thanks a lot. We just infected cells with mCherry-LC3B lentivirus and will
see...
Antibodies from Cell Signaling and Abgent are just not working for us...
because
convince
autophagy
level
more
ask for |
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c*******7
发帖数: 28 | 39 在尝试用FACS区分表达EGFP／RFP的两种细胞,希望最后能统计出两者的ratio
但是奇怪的是,EGFP在FL1,FL2两个通道的分布几乎完全相同,不能区分
用的是pEGFP-C1载体,EGFP在N端,无插入序列,共聚焦显微镜下表达正常,用红色荧光通
道无法检测到
转293T cell，没有做任何固定,仅用PBS重悬
同时看了RFP或者mcherry,就可以用FL2通道检测,在FL1上信号很弱,可以区分出来
想问一下大家有没有遇到这样的情况?这是质粒本身的问题还是机器调试的问题? |
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t******y
发帖数: 716 | 40 最近要做蛋白追踪，活细胞显影。但是没有亚细胞结构的荧光蛋白。如果哪位朋友有表
达mCherry，CFP等荧光蛋白偶联的ER，Lysosome或Golgi Marker的质粒，请和我联系。
不胜感激！ |
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s******9
发帖数: 283 | 41 我的DsRed fusion的maturation time也很长。mcherry要好很多。 |
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W*******a
发帖数: 1769 | 42 换单体的, mCherry, orange, apple, banana, etc. |
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s******e
发帖数: 370 | 43 从前用dsRed也碰到过类似问题，当时还兴冲冲的以为co－localization就此做成……
好像现在Tsien实验室已经不建议大家用这个荧光蛋白了，有可能的话换成mCherry？ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 44 thank you sunny.
i think I have the last one. so that is why I only see the GFP but not
mcherry and CFP. Sign. |
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b******s
发帖数: 1089 | 45 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 46 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
麻烦来了
1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
commercial的 |
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h**********r
发帖数: 671 | 49 td-Tomato和mcherry都可以，用tac或者trc promoter都可以，不想用IPTG诱导的话，
去掉或者破坏lacI
可以看看这个AEM
Broad-Host-Range Plasmids for Red Fluorescent Protein Labeling of
Gram-Negative Bacteria for Use in the Zebrafish Model System
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, June 2010, p. 3467–3474 Vol. 76, No
. 11
doi:10.1128/AEM.01679-09 |
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