b****r
发帖数: 17995 | 1 谢谢
你读得比我更仔细,那个unzip double strand 的步骤确实没看到。
至于最后要多少个coverage，我没有算，你的描述里也没说出来，还是难以作出结论，
也许nanopore的coverage可以做到很高，这个还得花时间仔细算算。不过我觉得这个是
很难蒙混过关的，只要nanopore把数据拿出来，中学生也能算到很清楚，到底最后
coverage 多高，每个碱基精确性多高
你说的PCR even out error，我不太同意。你看看这个图
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n12/fig_tab/nmeth.1270_F
如果我没搞错，illumina现在仍然是基于这个原理，我理解的PCR是左下最后一个蓝框
，不是右第三个黄框。前面这个amplification仍然是error prone的，特别是对于染色
体的很多区段，可能扩增效率很低，而且还有pcr的error问题和allelic dropoff的问
题（这些缺陷nanopore都应该没有）。实际上你去看illunima 的raw data，错误还是
相当多的，不是你... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 2 MinIon@ 2014 上半年 上市 试用
https://twitter.com/nanopore
Guidelines for applying for the MinION Access programme (MAP). Please scroll
to the bottom of this page to view the application form.
Each application should be made by an individual. One application will be
accepted per person and there is no limit on the number of applications per
institution.
Each applicant can apply for up to 50 MAP packages. Each MAP package
includes a single MinION and corresponding supply of flow cells/preparation
kits.... 阅读全帖 |
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y******8
发帖数: 1764 | 3 Ion刚出的时候，我觉得HiSeq会在5年内被取代。
现在Nanopore出来了，Ion如果没有本质的突破，将会和HiSeq同时同命运。
与Nanopore比，Ion的速度处于劣势，读长劣势。
如果是比较raw error的话，Ion也没有优势可言。算法校正上，我对life没有太大的信
心。
最后比较通量，如果Nanopore的膜形状不是平面，而是多曲面，体积不便，这个通量增
加的办法可比Ion downsize well容易多了。
如果Ion不需要bead和emPCR了，估计还有一拼。 |
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f*******e
发帖数: 628 | 4 一般的 sample amplification 是把一个单分子原始 DNA 在一个 bead （或者其他介
质）上扩增成序列一样的的足够多数量的分子。 这个过程产生的 error 很小，比如 <
0.1%, 可以忽略不计。说这个过程可以纠正 error, 是因为在后续 sequencing 的时候
是读取的 amplification 之后整体产生的信号，所以即使这个集合里面某些少量的分
子产生错误的信号, 也淹没在 noise 里，不影响集合读出的正确序列.
相比较之下，single molecule 的方法只读取一个原始分子的信息，比如 nanopore,
读错了就错了，没有这么一个纠正的机制，所以就只能靠大量的 coverage 来弥补。
根据 nanopore 的网站，他们用某种 dsDNA binding enzyme 在 nanopore 的端口来
unzip double strand, 所以最后通过 pore 读取的是 single stranded
trinucleotide。一个分子被测序之后不会回来反复被测。所以要靠测序的 coverage
来弥补错误的话，就需... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 Illumina won first round Competition before QE2 of 2013
Genomics Conference Illustrates that Illumina is Outpacing the Competition
Ivan Deryugin
March 15, 2013
On the evening of March 14, Illumina (ILMN) announced that a federal jury
found it guilty of infringing a patent held by Syntrix Biosystems relating
to the company’s BeadChip product line, fining Illumina $96 million based
on a 6% royalty on all BeadChip sales between 2005 and September 2012 (
Syntrix’s lawsuit was filed in November 2010)... 阅读全帖 |
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A*****2
发帖数: 7 | 6 Postdoc Position on Nanoporous Materials Processing and Applications
A postdoc position is available in the Multifunctional Materials Research
Laboratory (MMRL) in the University of California, San Diego (UCSD), under
supervision of Professor Yu Qiao ( http://mmrl.ucsd.edu ). The postdoc will be involved in researches on processing of a variety of nanoporous materials, including nanoporous ceramics, carbons, metals/alloys, and polymers, as well as their novel applications in energy-related and/o... 阅读全帖 |
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y******8
发帖数: 1764 | 8 pacbio的单分子相互必须有一定的距离，这严重限制了通量。第二，它的chemistry有
很大的缺陷，造成raw error 1/3.
ion做到了每半年升四倍。不过以后它基本上就downsize bead这一招，downsize 一半
，通量就升四倍。
Nanopore可以改进的地方太多了，我还没法算出其通量的上限。原则上，DNA上样浓度
可以远远大于其他办法，不受单克隆限制。
技术上，Nanopore没理由不会四年后远超Ion |
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f*******e
发帖数: 628 | 9 都有错误，所以 illumina 454 啥的都要事先 sample amplification。这个 nanopore
既然号称不需要 sample prep, 就需要解决单分子测序的 error 问题。当然如果
sample 本来就是 amplicon 就无所谓了。
哪个文章？他们网站上说是有两种 mode，其中一种是用 exonuclease 的。我理解那个
strand sequencing 不用 nuclease，但是具体怎么 把 double strand 弄成 single
strand，然后 single strand 通过了之后如何 recover 不是太明白。
我没以为是单细胞测序，所以才说 error 要通过 coverage 来解决。而 PacBio 的某
个解决 error 方法是循环的重复测某一个单分子，这一点 Nanopore 好像做不到，因
为我的理解是某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低。这个 error 的问
题，特别在 sample 本身很少的情况下，比如一个 finger stick 的血样，不能解决的
话就是个问题。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 10 我倒是考虑一个关于error的问题，nanopore的error是不是随机的？
illumina等现在的方法，虽然error有bias，但是大致是随机出现的，
当然一堆T啥的可能错误多点？那么从nanopore的原理来说，考虑到
周边碱基影响，那么会不会对某一块序列怎么读都有很高的错误率？ |
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f*******e
发帖数: 628 | 11 第三点不是太明白。为什么 nanopore 依赖于长而完整的 DNA 来测量呢？Nanopore 在
测长的DNA 上面有优势，号称没有 read length 的上限，然而我没有找到导致它不能
测短的因素啊？比如几百个 bp 的 amplicon, 难道不能被 capture 来读取么？
板？ |
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h*********r
发帖数: 2844 | 12 那个oxford nanopore 一年前吹了很大的牛，现在还没任何动静，也没数据。nanopore
方面的研究很多。谁能说说这个技术feasible 吗？有没有什么终极技术瓶颈？ |
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b****r
发帖数: 17995 | 15 nanopore都“出来”好几年了，现在还没个屁响，还是先确定nanopore不是扯淡的，再
说别的吧 |
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O*T
发帖数: 7 | 16 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: ONT (就看看), 信区: Biology
标 题: Oxford Nanopore 纽约再次招人
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 5 06:57:10 2015, 美东)
Technical Applications Specialist：
https://nanoporetech.com/careers/job-centre/view/211
对于想转行又不想完全丢了专业的是个机会 - "These roles will suit a research/
postdoctoral scientist looking for their first (commercial) role in industry
or continuing to develop their commercial role further. Full training and
support will be given." |
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m***T
发帖数: 11058 | 17 It's too early to tell at this moment. We will have to see how good the
data quality is and what the throughput will be. Not their internal data
but from early access customers using real samples.
If nanopore is not a real contender, I don't see why Proton will drop
price right after launch. |
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s******s
发帖数: 13035 | 18 这都是假设nanopore能够按照预想的速度推出，升级。。。
ion还号称每半年升四倍呢，这个你怎么不考虑？
pacbio还单分子呢，不能deliver还是白吹 |
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f*******e
发帖数: 628 | 20 如果不扩增，很难保证能够重复多次的测某个特定分子的某个特定片段吧，这样就很难
判断错误是来源于测序错误或者 real 吧？
看了看好像不能像 PacBio 一样不停的轮回对同一个分子测序。Nanopore 的技术好像
至少用那个 exonuclease 的是测序同时也摧毁分子。Strand sequencing 也许还行，
不过很难保证这次测了之后还能再 capture 到同一个 strand 来测啊？
到最后 error 大概只能靠 coverage 来解决。
了。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 21 illumina 454也都有错误也都不能轮回测同一个分子啊。只要某些DNA片段不会选择性
的不能通过那个pore，很难想象在足够多coverage后还会有大的gap。
nanopore不用nuclease切DNA啊，你在哪里看到的。文章里明确说了，测完后还能
recover DNA的。它这个理论上就是靠DNA不同的碱基和那个pore蛋白的物理互作测序，
可能是氢键吧
难道你以为是单细胞测序？不是的啊，打比方他说把血液直接加上去，血液里那么多白
细胞，每个里面都有两个copy的基因组 |
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b****r
发帖数: 17995 | 22 sample amplification不是为了纠正错误吧？我记得一个是为了增大样品量，一个是为
了在amplicon两头加adaptor。amplification怎么纠正错误，你可否解释一下？
exonuclease干嘛用我确实也没看到，也许是把Mb级别的DNA搞成几十KB的，好一次测一
条吧
“某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低”，我在楼上帖解释了我的看法。
一个finger stick，那白细胞确实太少了，我不认为现在任何技术能很好地对其进行高
质量的NGS
nanopore
single |
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f*******e
发帖数: 628 | 23 文章说，Only about 0.001% of the starting DNA is processed。这才是他们号称不
消耗，可以做完之后还回收做别的。这样一个几率，比如你的例子，20000 个 copy,
只有 0.2 个分子有机会被测序到。所以这样一个 input，至少需要等 5x 的更长时间
，才可能被 process 到。而因为他们的 error rate 高，需要更高的 coverage, 所以
真正需要的时间更长。这样算一下，他们的 throughput 也有待提高。只处理 0.001%
的 starting material 感觉并不是什么好事，需要测的 target molecule 的丰度足够
高才行，量大都没用。
nanopore 通过的机制，感觉好像是通过 motor enzyme 来 ratchet，通过机械手段大
概不太能够做得足够小。 |
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f*******e
发帖数: 628 | 24 我之前说的 amplification 的 error 就是指的在 bead 上面的 PCR，这个 error 是
在别的非 single molecule 方法里面可以 even out 的。之前 library prep 之类的
PCR，Nanopore 如果需要做，error 啊，bias 啊之类和其他方法相比没有劣势，大概
就是没必要用 adapter 吧。
需要多少 coverage, 我当然不知道，呵呵，每个系统可以自说自话，自己定义一个下
限，关键就是 customers 是不是接受了。还有就是用途不同，也许 4% 对有些人完全
不是问题。再加上 read length 长，这样 alignment 的 confidence 高，这里面如果
有因为 error 造成的 misalignment 也可以通过别的数据处理方法来弥补。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 25 nanopore都说不纯化血样或者其他样品，可以说肯定是没有library prep的步骤的。你
说得很对，我们讨论半天，最后还得靠它自己拉出来溜溜看
很高兴能结识你这样的高手，希望今后能多交流
的 |
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s******s
发帖数: 13035 | 26 关于3，你是技术更新了老的方法都忘了。在next gene之前，用测序测表达，
就把cDNA加接头，然后切成固定大小片段，然后几十个ligate在一起，作为
一个反应去测序。nanopore显然可以用这样的方法，也就是样品要处理一下
而已，这个比library还是简单
板？ |
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b******n
发帖数: 4225 | 27 我觉得还需要市场考验
牛刚开始都吹，二阶导数三阶导数的提升（差别）都可以理论上分析出来
但是实际上怎么样要等等看
nanopore |
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h*********r
发帖数: 2844 | 28 文中"the latest dna sequencing technology" 是nanopore技术吗？为什么这么偷偷
摸摸不肯明说泥？
in
which
The |
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s****l
发帖数: 10462 | 30 看来年底之前，是骡子是马就差不多知晓了。
ILlumina是不是有15%的股份，还有 right to negotiate until 2016?
如果accuracy不错的话，Ion Torrent比较麻烦 --- 快速，价格都比不上，accuracy又
不高很多。
nanopore sample preparation 似乎很简单，才6个eppendorf管子就解决了。是不是我
看错了？ |
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h*********r
发帖数: 2844 | 31 这些大牌公司，脑子都不好使吧。很可能过几天他们又屁颠屁颠去求nanopore合作了。
难怪当年Ilumina坚决不理他们。 |
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f*******e
发帖数: 628 | 32 做高密度sensor测微小电压不难。难的是每个sensor能分辨四个不同碱基产生的微小电
压之间的不同。 或许测的是信号维持时间的长度区别？不知道准确度如何。Nanopore
总是这么奇怪，只公布产品信息，不提供任何真正的数据。
Ion |
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s******s
发帖数: 13035 | 33 你搞错了吧. 你说的这么多, 大多数有电都是nanopore的特点, 不是
MiniIon的优点. 显然有GridIon在那里, 而且大多数地方有facility,
miniIon的优势在哪里? 除了我说的sample很少, 后者时效性地域性比较
严格的研究, 一点好处都没有 |
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f******t
发帖数: 2699 | 35 杂交荧光测序？我还以为是按不同碱基通过nanopore产生不同电流信号。我没看过他家
的原理，道听途说而已。如果是杂交的话，就不能读Cm了吧？那PacBio也许还有发展前
途。
现在这个已经能应用了么？有人知道error rate是多少吗？PacBio的都超过10%了，基
本可以直接进垃圾桶，还要靠illumina来纠错。 |
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s****l
发帖数: 10462 | 36 我也不是特别清楚原理，感觉上就是单分子的序列上的四种碱基通过nanopore的时候电
压不同。然后因为末端处理了一下，正反方向都读一次。再就是跑的时间越长，输入越
高，但是有各种限制因素。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 37 pacbio可以反复测, 所以10%不是大问题. nanopore我觉得准确率
很难搞啊, 不知道数据是多少 |
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z*t
发帖数: 863 | 39 这个不同的修饰蛮好玩的，pacbio当年对methylated A测得很好，但是对不同modified
的cytosine要靠DNA修饰处理才能很好的测定。nanopore测modified cytosine估计不会
比pacbio容易，如果用有一些修饰处理的手段应该会有不错的结果 |
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s****l
发帖数: 10462 | 41 看来年底之前，是骡子是马就差不多知晓了。
ILlumina是不是有15%的股份，还有 right to negotiate until 2016?
如果accuracy不错的话，Ion Torrent比较麻烦 --- 快速，价格都比不上，accuracy又
不高很多。
nanopore sample preparation 似乎很简单，才6个eppendorf管子就解决了。是不是我
看错了？ |
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h*********r
发帖数: 2844 | 42 这些大牌公司，脑子都不好使吧。很可能过几天他们又屁颠屁颠去求nanopore合作了。
难怪当年Ilumina坚决不理他们。 |
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f*******e
发帖数: 628 | 43 做高密度sensor测微小电压不难。难的是每个sensor能分辨四个不同碱基产生的微小电
压之间的不同。 或许测的是信号维持时间的长度区别？不知道准确度如何。Nanopore
总是这么奇怪，只公布产品信息，不提供任何真正的数据。
Ion |
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s******s
发帖数: 13035 | 44 你搞错了吧. 你说的这么多, 大多数有电都是nanopore的特点, 不是
MiniIon的优点. 显然有GridIon在那里, 而且大多数地方有facility,
miniIon的优势在哪里? 除了我说的sample很少, 后者时效性地域性比较
严格的研究, 一点好处都没有 |
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f******t
发帖数: 2699 | 46 杂交荧光测序？我还以为是按不同碱基通过nanopore产生不同电流信号。我没看过他家
的原理，道听途说而已。如果是杂交的话，就不能读Cm了吧？那PacBio也许还有发展前
途。
现在这个已经能应用了么？有人知道error rate是多少吗？PacBio的都超过10%了，基
本可以直接进垃圾桶，还要靠illumina来纠错。 |
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s****l
发帖数: 10462 | 47 我也不是特别清楚原理，感觉上就是单分子的序列上的四种碱基通过nanopore的时候电
压不同。然后因为末端处理了一下，正反方向都读一次。再就是跑的时间越长，输入越
高，但是有各种限制因素。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 48 pacbio可以反复测, 所以10%不是大问题. nanopore我觉得准确率
很难搞啊, 不知道数据是多少 |
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z*t
发帖数: 863 | 50 这个不同的修饰蛮好玩的，pacbio当年对methylated A测得很好，但是对不同modified
的cytosine要靠DNA修饰处理才能很好的测定。nanopore测modified cytosine估计不会
比pacbio容易，如果用有一些修饰处理的手段应该会有不错的结果 |
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