C****n
发帖数: 79 | 1 先感谢版上的各位大虾，经过trouble-shooting，CRISPR在我们这个真菌里总算work了
。不过现在有个现象我解释不清楚，由于本人遗传学不是很强，所以想再次请教一下专
家。
我拿到单mutant后，sequence了target，但是很奇怪，sequencing结果显示我们这个
diploid的真菌只有一个单一的mutated target，这是为什么呢？NHEJ是随机的，理论
上说， diploid应该会出现两个allel不同的情况。是发生了gene conversion了，还是
其他原因？谢谢 |
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w***a
发帖数: 4361 | 2 偶也有介个问题，genomic PCR以后测了20个克隆，全部是一摸一样的突变。
估计NHEJ修复的时候，某些错误出现的频率很高吧，
所以也不见得就是完全随机的mutation。也许跟guide sequence target的位置有关。 |
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A****A
发帖数: 16 | 3 目前的观点是，HR和NHEJ是在DNA双链断裂修复中互相竞争的pathways。如果能够有效
的抑制NHEJ,HR的频率有可能会有大幅度的提升。目前，一些labs主要通过knock out或
者knock down NHEJ中几个关键player， 比如，Ku70， Ku80 以及Ligase4，来进行验
证。比较convincing的data有Dana Carroll在果蝇的研究，以及Eric Hendrickson在
mammalian cell line中的研究。Paper 如下:
Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jun 24;105(25):8703-8. Epub 2008 Jun 18.
Ku70, an essential gene, modulates the frequency of rAAV-mediated gene
targeting in human somatic cells.
Fattah FJ, Lichter NF, Fattah KR, Oh S, Hendrickson EA.
Genetics. 2009 Jul;1... 阅读全帖 |
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j****n
发帖数: 3370 | 4 难道是Yarrowia？
nhej效率非常高 我同学试着加nhej抑制剂 看看能不能提高效率
你也可以试试
[在 CHUNan (CHUNan) 的大作中提到：]
：这方面没有系统的研究，但是circular载体转化以后，大部分是整合在genome 的
：transposon 里，所以应该是NHEJ率很高，对吧？
：........... |
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n*******d
发帖数: 41 | 5 同源重组，反正目前没看到突变，所以应该不是NHEJ
菌神觉得NHEJ对他不重要
：什么叫重组？NHEJ？这种插入方法两端不会有很多突变吗
： |
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z*t
发帖数: 863 | 6 上次记得板上有讨论talen的时候提到了抑制NHEJ，后来我在问一个搞yeast HR的人时
，他不建议抑制NHEJ，因为这是对细胞生存必须的，抑制后可能会sth wired happen。
大家有什么看法？ |
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g*****n
发帖数: 250 | 7 继续读。
Figure 5。用NgAgo切掉两个荧光蛋白基因之间的STOP codon，使两个蛋白成为融合蛋
白。这个必须在stop这个位置切掉三个核苷酸，使两个编码区in-frame。多一个不行，
少一个也不行。
Figure 3显示，NgAgo随机地切掉数量不等的核苷酸。在24nt guided区域里，所切得的
产物类型应该是很多，很多，很多。可以想象，在这样24nt区域里，既要准确地在stop
位置上，又要只切掉三个。懂数学的给算算，这个机率将是多少。（这还没把NHEJ带来
的错误算上）。感觉有点天方夜谭。作者好像心里也没底。“Imprecise genome
repair mediated by nonhomologous end joining (NHEJ) mutated the TGA
terminator and made the expression of mRFP-eGFP chimera possible” 这么关键
的实验，没有测序确定，就一句猜测性话。 |
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x****6
发帖数: 4339 | 8 从编辑对DNA的效果来看，可以分为 敲除（knock-out）和 敲入（knock-in）。
敲除，故名思意就是让目标基因失去功能。这个相对容易实现。因为基因经过长期的进
化出来的精细结构，随机的删除或者添加几个碱基对(生物里的0 1）就能让目标基因
失效。
如何实现？CAS9或者其他的核酸酶，在破坏DNA双链以后，细胞会自动修复损伤。这个
修复的机制叫做非同源性末端连接（Non-homology end joining,NHEJ）。就是直接把
绳子断开的两端直接连接回去。但是这个过程不精确，大概率的会随机造成几个碱基对
的删除或者添加。那么正好就可以让基因失效。
这就是贺所采取的手段：基因敲除。
-------------------------------
第二种，敲入。和敲除相反，把一段给定的DNA序列精确的整合进入目标基因组位点。
精确是这里的关键词。敲入的结果就是编辑以后的目标基因的新序列和预先设计的要一
模一样，这就和 随机 的“敲除”形成鲜明对比。显然，敲入 要比敲除 更牛逼：你想
要什么就有什么，而不是靠运气。
如何实现？同样的，用CAS9或者其他的核酸酶切断DNA双链... 阅读全帖 |
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l****9
发帖数: 6 | 9 纠正一点，DNA双链断裂后NHEJ修复时，随机发生的插入与删除碱基数并不限于几个，
可能达到数千碱基。 |
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Z**********g
发帖数: 14173 | 10 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: xiaxianyue (下弦月), 信区: Joke
标 题: 本钱老来点评基因编辑人类实验
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 30 14:48:36 2018, 美东)
刚花了半小时码了个长文，丢了，生无可恋……先占个坑。
你们，包括什么杀生丸都没说到重点。
先说一下贺的逻辑吧。多方证据显示携带CCR5delta32突变的人具有抗艾滋能力。而最
近大热的CRISPR/Cas9 genome editing技术使科学家现在有了“相对”定向修改DNA序
列的能力。所以利用CRISPR制造含有CCR5突变的人，会使该人获得抗hiv的能力。
这个逻辑门外汉看着会觉得相当很合理。很多在生物学界分一杯羹的物理/工程学家也
确实是按这个逻辑搞钱搞文章。可惜，贺还有贺的老板都缺乏真正的生物学背景。他们
和生物学家合作的时候没问题，但当他们自己开始搞生物，就会搞出大篓子。如果他们
在小鼠或者猴子里做这个实验，也就发一个二三流paper。但是他们野心太大，居然先
斩后奏做了人体实验。
接下来分几个点讲这个实验为什么破绽百出狗屁不通。
首... 阅读全帖 |
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x****6
发帖数: 4339 | 11 你把机制搞错了
第一步，只有酶切：Cas9水解DNA骨架的；但是没有突变
第二部，细胞通过NHEJ机制来修复双链断裂，这一部会出随机的indel突变
。2 |
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x****6
发帖数: 4339 | 12 非特异性结合而发生的DNA骨架水解反应，也不产生突变啊
但是在细胞修复这个断裂的DNA骨架的时候，突变会由NHEJ机制造成，跟你的第二部是
一样的 |
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发帖数: 1 | 13 Argonaute (Ago) proteins are complexed with small DNA or RNA guides and
cleave nucleic 24
acid targets whose sequences are complementary with the guides1. Agos in
eukaryotes bind 25
to small interfering RNAs (siRNAs) or microRNAs (miRNAs) to suppress gene
expression by 26
degrading mRNAs in a targeted manner, a regulatory process known as RNA
interference 27
(RNAi). Agos in eubacteria and archaea are complexed with DNA or RNA guides
and function 28
as defense systems against foreign mobile genet... 阅读全帖 |
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m***e
发帖数: 482 | 14 DNA repair pathways:
-direct repair
e.g. thymine dimers (DNa photolyase),
DNA adducts caused by alkylating agents (methyltransferases)
-excision repair
base excision repair(BER)
mismatch repair(MMR)
nucleotide excision repair(NER)
-recombinational repair
DNA double-strand break repair: 2 distinct system in eukaryotic cells
1. homologous recombination system
2. non-homologous end-joining (NHEJ) system
en, DNA-dependent proptein kinase is required for normal double-strand break
rejoin |
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p*****m
发帖数: 7030 | 15 ZFN在鱼里目前就是用来造成NHEJ来形成mutation的 你说这个增加HR效率的事情 目前
好像还停留在我脑子里 当然也许已经有人开做了:) |
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A****A
发帖数: 16 | 16 利用ZFN等reagents做Knock in应该是一些lab目前的奋斗方向。ZFN可以产生sequence
specific DNA double strand break. DNA双链断裂可以有效的提高homologous
recombination的频率，从而达到Knock in的目的。目前，在fish里面实现高效的HR还
很困难，即使在有ZFN的帮助下。我不是做fish的，主要做DNA repair pathway. 我觉
得可以通过一些genetic或chemical的手段抑制fish的NHEJ pathway，来增加HR的频率。
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 17 嗯 这几天刚有paper出来show这个的。请问一下有什么具体思路来一直NHEJ,然后这个
为什么能促进HR呢？我对这些分子生物学东东一窍不通 要是有相关文献就更好了哈 多
谢多谢
sequence
率。 |
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x**w
发帖数: 112 | 18 ＵC Berkeley的Sharon Amacher 2010年fish meeting上就有post说在抑制NHEJ的条
件下促进hr的尝试，当时已经拿到heters 了，搞不好过两天文章就出来了，大家还在
这里扯。。。。呵呵。。。
transformation |
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i*****g
发帖数: 11893 | 19 NHEJ HR
我2003年就接触了，也是个焦头烂额的领域
发文章是可以的
但要指望它做些事情，提高HR之类的，这个叫产品，或工具。从文章到产品 还有一段路
生物系统，凡是卷入N个蛋白，别指望容易的事情 |
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d****u
发帖数: 1553 | 20 CRISPR引起的DSB是由NHEJ来修理的，这个过程应该说是超级的不精确，删除的碱基数
从几个到10几个到几十个不等。你这个精确剪切的概率应该是非常非常低的。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 21 什么跟什么？homology arm is for homology directed repair.
HEJ? NHEJ non-homologous end joining?
你说的是哪个？ |
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a*******a
发帖数: 4233 | 22 一般dna dsb以后被nhej修复时容易出现。njej非特异性连接末端后有的染色体有两个
centromere,有的染色体一个
都没有。一个都没有的染色体在细胞分解时没东西拉着就会掉出来形成micronulei,，
有两个centromere的会被拉向相反的方向最后拉断，(breakage-fusion-bridge)并且减
慢分解速度甚至干脆
spindle无法分离最后形成一个两个核的细胞。
当hr通路失活时这种现象比较多。 |
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w***r
发帖数: 709 | 23 大多数细胞系同源重组率非常非常低。ES细胞同源重组比较高。
可能和细胞dna修复的machinary有关。nhej 比较强,等等。
不同的转染方法也影响重组率，比如ES,普通转染的重组效率远低于电转
另外细胞系,比如 3t3,都是多倍体，而且没办法通过交配形成KO。
有rnai,很多时候没必要做Ko. |
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r******g
发帖数: 600 | 24 我完全混乱了
楼主说的这种情况，为什么需要药筛呢？
直接把 在 exon 或者 exon junction的 DNA double strand 用Cas9 break了，NHEJ不
就把target gene给敲了么
然后做单细胞克隆，然后再PCR筛，sequencing confirm，难道这样不是简单些么？ |
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Z**********g
发帖数: 222 | 25 最近不是出来两篇Nat Biotech的文章吗，说是用小分子抑制NHEJ可明显增强HDR效率。
不知效果如何。 |
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j******i
发帖数: 939 | 26 记得bacteria里边NHEJ效率低而HR效率却非常高
replacement |
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a*****i
发帖数: 2108 | 27 我是做fungi的，但是是酿酒酵母，HR活性很强所以非常好用。我听朋友说他们一直想
在pichia里用cas9，但是一直不work，应该就是HR不够造成的。问个问题，你这个菌的
NHEJ activity怎么样？ |
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C****n
发帖数: 79 | 28 这方面没有系统的研究，但是circular载体转化以后，大部分是整合在genome 的
transposon 里，所以应该是NHEJ率很高，对吧？ |
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C****n
发帖数: 79 | 29 谢谢这个信息。
其实我倒是希望想按照通常大家做的，先拿到NHEJ 的mutant，然后倒入donor DNA，然
后再HR。因为直接Gene-knock-out已经try了decades了。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 31 也有可能是同源重组了
之前做polyploid 如果没有全部敲除 没有筛选压力的话 又全部变回widtype了
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1 |
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C****n
发帖数: 79 | 32 两个allel都改了倒是不错，但是都改成一样的。另外我没有加入donor DNA，这就很奇
怪。 |
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C****n
发帖数: 79 | 33 你说的这个就是gene conversion吧. |
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C****n
发帖数: 79 | 34 我随机挑取了5个单clone， 提gDNA， PCR然后测序，这五个mutants之间的序列是不同
，但是对于每一个clone，只有一个测序结果，也就是说两个allel都突变成一样的序列
，这就很奇怪。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 35 和你描述的有啥区别？只是一个convert to wildtype 你的是convert成另一个allele
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2 |
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w***a
发帖数: 4361 | 36 我的也是这种情况，puromycin筛选以后，随机挑了6个clone，
结果5个是wildtype，只有一个是突变。
这个突变克隆，测了20个genomic PCR product，发现全部是同一个突变。
当时偶也觉得蛮奇怪的，后来western做完，目标蛋白确实没了，就不管了这事了。。。 |
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w***a
发帖数: 4361 | 37 会不会挑细胞的时候，挑的不是单克隆？
如果混入wildtype细胞，没有筛选压力，时间长了knockout细胞肯定被稀释没了撒。 |
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j****n
发帖数: 3370 | 38 做了这么多年 还不至于吧
挑了好多的克隆 都是这个样子
尤其是某些yeast 同源重组的效率很高 可以想象 这种情况的同源臂无限长。。。 |
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n***y
发帖数: 114 | 39 一个allele利用另一个allele作为修复的模板，两个alleles切割和修复不是同时发生
的，一前一后
。可以参考我以前发的帖子，MCR。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 40 什么叫重组？NHEJ？这种插入方法两端不会有很多突变吗
PCR |
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s**2
发帖数: 1287 | 41 今年诺奖化学奖的选择的确挺糟糕的。
除非他们是想留着HR和NHEJ方向来年再发。:D |
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x********e
发帖数: 35261 | 42 关键是她用的NHEJ诱导突变，这是CRISPR里最简单的一种。copy number对gRNA来说没
影响啊，只要你往细胞里加足够多的gRNA，总能全部target吧。
我看过别人用CRISPR做Megabase尺度上的inversion，deletion，duplication构建小鼠
疾病模型的paper，那才牛。
wonder |
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发帖数: 1 | 43 他的意思是用一个gDNA引导NgAgo去切某段序列，切割之后，两段序列通过NHEJ再次连
接，如果中间被切除很长的话，那么在上游和下游各找一个引物扩这个区域，理论上如
果得到的带中，有稍微变小一点的带就表明NgAgo起作用了。而他的图中除了最上面那
个wild-type的带（没有任何切割），其余的带都特别小，我很诧异，他一个guideDNA
如何做到敲掉几百个碱基的 |
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m****a
发帖数: 270 | 44 没道理，因为韩春雨同志曾经说过
“按照讲座说的，完全按照supplementary data里面general protocol做，能重复出来
。”
他还曾经教导我们：
“照着Protocol of NgAgo/gDNA-mediated genome editing and examination (T7E1
assay) and a representative experiment来一遍，做出来好像也没那么难。有那么难
？按北大讲座说的直接做gfp doner NHEJ knock in，3天能直接能
看见插入表达”
如果这些都做不出来那你就别做分子生物学了，直接转行吧。 |
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发帖数: 1 | 45 你说没道理，那绝对肯定没道理了。哈哈
: 没道理，因为韩春雨同志曾经说过
: “按照讲座说的，完全按照supplementary data里面general protocol做，能重
复出来
: 。”
: 他还曾经教导我们：
: “照着Protocol of NgAgo/gDNA-mediated genome editing and examination (
T7E1
: assay) and a representative experiment来一遍，做出来好像也没那么难。有
那么难
: ？按北大讲座说的直接做gfp doner NHEJ knock in，3天能直接能
: 看见插入表达”
: 如果这些都做不出来那你就别做分子生物学了，直接转行吧。
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c********n
发帖数: 225 | 46 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- 发布时间：2016年8月16日
- 发布平台：twitter
- 发布方国家：日本
- 发布方城市：东京
- 发布方研究机构：Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science東京都医
学総合研究所
- 实验室PI：Dr Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
- 应用验证实验详细信息：
−参考2016年8月8... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 47 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- 发布时间：2016年8月16日
- 发布平台：twitter
- 发布方国家：日本
- 发布方城市：东京
- 发布方研究机构：Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science東京都医
学総合研究所
- 实验室PI：Dr Yuichiro (Ichi) Miyaoka 宮岡佑一郎 博士
- NgAgo的来源：Addgene
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果
- 应用验证实验详细信息：
−参考2016年8月8... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 48 Indel在我们的细胞里面也是非常高的，几乎所有的筛选出来的细胞，两个拷贝都是被
切割了的，问题是经常只有一个拷贝通过同源重组把筛选标签和突变位点knock-in，另
一个拷贝却是NHEJ。
问题就是同源重组效率太低了，是不是因为我的同源臂之间的插入序列太长，我的有
5000多bp。 |
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s*********y
发帖数: 292 | 49 Cas9一直能切非分裂的细胞，这文章只是说可以通过NHEJ在不分裂的细胞内做knock in |
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j****n
发帖数: 3370 | 50 没试过
有两个小疑问
ko除非用hr把整个cds干掉 不然即使ko了 transcriotion不受影响吧 nhej一般也就几
个bp的变化
如果只ko掉一个allele 会显著影响基因的表达吗？印象中 一些highly regulate gene
一个copy或者两个copy 转录水平没啥区别 |
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