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N****O
发帖数: 4202 | 2 好像是！
我刚查到一篇文献，就是用Ni-NTA agarose纯化survivin的，谢谢！！！ |
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l**n
发帖数: 109 | 3 也可以试一下Cu柱
如果NTA不行就试一下IDA柱 |
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x**x
发帖数: 92 | 4 非常感谢分享protocol, 看起来非常有道理， 我准备试试你的方法。
你的蛋白正常低温诱导也全在inclusion body么？
用了你的方法， 最终产量有多大，能有 mg per Liter 么？
另外，T7 RNA Polymerase 本身就非常可溶呀。低温诱导，正常Ni-NTA纯化，上次我做
了1升，提了20mg蛋白。
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s*******e
发帖数: 1010 | 5 Talon背景干净，但是钴的亲和性低于镍。
Qiagen的NTA亲和能力强，但是杂带也会多一些。 |
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o*****r
发帖数: 156 | 6 Qiagen NTA, add 10-25 mM imidazole in the sample and buffer to reduce non-
specific binding |
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f*****e
发帖数: 133 | 8 是Ni-NTA beads?这个不能加EDTA的吧？ |
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k****k
发帖数: 36 | 9 提纯蛋白，头一步用含有imidazole的buffer从NI-NTA column洗脱。用FPLC Q column
再次纯化之后，发现仍有imidazole残存。有人遇到过同样情况么？应如何解决？谢谢
。 |
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z***g
发帖数: 28 | 10 Hey guys
I am doing purification of membrane proteins to get enough concentration for
NMR study, the protein was labeled by his-tag
Firstly, the protein was expressed by E. coli, lysed by several enzymes,
agents and detergent(empigen) to solublize everything, then it was purified
by Ni-NTA column, the protein shows at the right MW(about 18KD) at commassie
blue stained gel.
However, the problem is, after the second purification---ion exchange on
Capto Q(pH 8.0), the protein which we collected doe... 阅读全帖 |
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z***g
发帖数: 28 | 11 效果可能不太好，明天好好照个像，marker左第一条是ni-nta纯化过的，第二条是ion
exchange纯化过的
for
purified
commassie
due |
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b******n
发帖数: 4225 | 12 好像在23KD那过了Ni-NTA柱也有一个条带，比较淡而已
ion exchange之后是不是只是enrich了这个non-specific band
如果可能搜集过ion-exchange的flow through跑一下SDS-PAGE
另外一种可能是蛋白沉淀之后trap在柱子里面了
ion |
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s*******e
发帖数: 1010 | 13 1. 我做过最大的是40kD vs 50kD，其实最重要的是解离常数，太高的话恐怕pull-down
的敏感度达不到；
2. 超声丢蛋白不太常见，你确认超声时候保持低温了吗？有时超声带来的高温会使蛋
白质变性；
3. 有可能是纯化条件没有优化好，有兴趣的话可以找个你们实验室做的成熟的His tag
蛋白做阳性参照试试你的纯化操作和试剂盒，或者换Qiagen的NTA或Clontech的talon
resin试一下。
祝你好运 |
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b******n
发帖数: 4225 | 14 可能蛋白的his-tag被包埋在蛋白里面了
如果不需要有活性的蛋白，直接变形了再去结合Ni-NTA
需要有活性的蛋白就要考虑将His-tag放到蛋白的另外一端试试看 |
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s*****a
发帖数: 59 | 16 忘说了，我就是用变性条件做His-purification的，用8M Urea, 100mM Phosphate,
10mM Tris, pH7.8做binding.
我确定His tag是表达的（based on size and DNA sequencing)。基于很多原因，不想
把 his-tag放到另一端。如果是变性条件，tag就肯定不会被包埋吧？
还有另一个可能，之前IP elution 有用1%SDS，之后做buffer exchange (Milliopore
Centricon)后可能SDS去除不完全。但是最坏可能也就是His-binding时有0.1%左右的
SDS，看Ni-NTA compatible list 应该不会影响binding啊 |
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W*******n
发帖数: 2762 | 17 从HEK293 cell purified 的蛋白，如何保存？要加glycerol, store in -80?
大家给些建议。 |
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H*g
发帖数: 2333 | 18 How long do you want to save it? |
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m*******8
发帖数: 256 | 20
期间需要反复使用的话最好就是加甘油，放-20度。 |
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W*******n
发帖数: 2762 | 21 Add 10% of Glycerol?
期间需要反复使用的话最好就是加甘油，放-20度。
thanks |
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m*******8
发帖数: 256 | 22
25%-50%。如果担心甘油会影响后面的实验就加25%吧。 |
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L*****t
发帖数: 56 | 23 不是所有的蛋白都适合加甘油。建议分装几个小管然,液氮速冻后放-80C. 每一次用取
一管。
如果是NiNTA纯化含高浓度咪唑的（Imizadole）要先脱盐或者透析，否则容易出问题。 |
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W*******n
发帖数: 2762 | 24 我的是有Imizadole（200mM), 这么麻烦。怎么脱盐？有protocol? |
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s********n
发帖数: 2939 | 25 -20C最好加50%，加25%经常还是会被冻上的。 |
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e********r
发帖数: 147 | 26 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
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e********r
发帖数: 147 | 27 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
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e********r
发帖数: 147 | 28 我们用最常用His tag + Ni-NTA（未加detergent）纯化到了一个可溶的细菌膜蛋白（
pET30a, 两个跨膜区）。虽然量很少，但有活性。Western blot和MS都鉴定该蛋白是正
确的。我们用这个蛋白做了论文里所有的实验。诱导条件是12度，24小时，0.5 mM
IPTG。
论文审稿后问题不大，但有个审稿意见让我们说明一下是“怎么纯化得到膜蛋白的”。
我猜专家是做蛋白结构的所以觉得很意外，但我怎么回答他比较合适呢？总不能说“我
纯化到了，所以我纯化到了吧”，这样审稿人会发怒滴，呵呵。请各位给个合理的建议
，谢谢。 |
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i***l
发帖数: 1656 | 29 “不用Detergent，还是可溶的细菌膜蛋白”？
这会是每个人的都有疑问--为什么没有Detergent就能提纯？还有活性？
（你也没说怎么破碎的 哪里表达的，Assuming是大肠，超声波。）
我估计，可能极少数穿莫蛋白和细胞膜在破碎过程中形成MICELLS，然后过柱子时候被你
拿到了。如果NTA柱子挂了蛋白后变成黄色，或者你的Elute是浅黄色，就很有可能是有
膜成分共同被结合，洗脱了。当然如果及少量，也可能看不到颜色变黄。
不怕麻烦的话，可以挑个简单的实验 加温和的Detergent （OG，DM，等等温和但是CMC
大点儿的），看看结果是不是一样。
Pierce的手册里有很好的关于Detergent的介绍 |
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l****y
发帖数: 398 | 30 我们做了一批anti-GFP和anti-mCherry的nanobody(15 KDa, single-domain antibody)
, 有两个用来做affinity purification/immunocapture很好用。
有需要的同学请通过站内信提供一个US non-profit research institute 的地址.
vector用e.coli 表达，periplasm加Ni-NTA纯化，一般可以拿到2mg/liter culture.
质量比多抗稳定，成本也低。适合需要做很多affinity purification的情况。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 31 你是用6xhis tagged的蛋白load在biacore的芯片上做么？
我们也想这么做，但是facility的人强烈不建议，说是NTA的biacore芯片表现很不好，
我们学校之前好多个组试过，没一个做出来结果是好的。现在我很苦逼的要把avitag
construct到我的蛋白上重新表达再标记biotin。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 MYC 的好像有了，FLAG 的还没有。
不过，你的问题的答案难道不是NTA-Ni + 6xHis 么？这个还不够小？ |
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y***o
发帖数: 416 | 33 http://www.sylzyhg.com/cn/gkll.asp
石油炼制与化工 2010年 第1期
40 周慧波 张舜光 侯凯湖
P和NTA对Co-Mo选择性加氢脱硫催化剂性能的影响
49 李广慈 赵会吉 赵瑞玉刘晨光
不同扩孔方法对催化剂载体氧化铝孔结构的影响
石油炼制与化工 2009年 第6期
29 何宗付 刘学芬 高晓冬谢刚
RS-1000催化剂在生产欧Ⅴ柴油中的应用
34 胡建忠 季宇明
RS-1000（S）器外预硫化催化剂在加氢装置上的应用
石油炼制与化工 2009年 第4期
1 徐黎明 高玉兰 李崇惠 陈光
硫化型加氢催化剂的制备研究
石油炼制与化工 2009年 第3期
12 周慧波 侯凯湖李会芳
TiO2-Al2O3复合载体焙烧温度对Co-Mo加氢脱硫催化剂性能的影响
33 吕浩 姚立松
RN-32V催化剂在3.2 Mt/a加氢处理装置的工业应用
Email: x********[email protected]
多谢热心朋友帮忙。 |
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y***o
发帖数: 416 | 34 就剩这三篇了，其余已经找到了。那天有孔给 SynThong 和 ShuperTech 发过去。
CoMo 和扩孔, Synthong 莫非是 Pinnavaia 的门徒? 前途大大地好啊。
http://www.sylzyhg.com/cn/gkll.asp
石油炼制与化工 2010年 第1期
40 周慧波 张舜光 侯凯湖
P和NTA对Co-Mo选择性加氢脱硫催化剂性能的影响
49 李广慈 赵会吉 赵瑞玉刘晨光
不同扩孔方法对催化剂载体氧化铝孔结构的影响
石油炼制与化工 2009年 第6期
34 胡建忠 季宇明
RS-1000（S）器外预硫化催化剂在加氢装置上的应用 |
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y***n
发帖数: 11261 | 35 Synthesis and Self-assembly Properties of Acylated Cyclodextrins and
Nitrilotriacetic Acid (NTA)-modified Inclusion Ligands for Interfacial
Protein Crystallization
Authors: Mingkang Zhou; Saubhik Haldar; Joseph Franses; Jong-Mok Kim; David
H. Thompson
Source: Supramolecular Chemistry, Volume 17, Numbers 1-2, Numbers 1-2/
January/March, 2005 , pp. 101-111(11)
这个link不知道要不要收费
http://www.ingentaconnect.com/content/tandf/gsch/2005/00000017/
Synthesis of radiolabeled cytarabine conjugates
Pallavi Lagi... 阅读全帖 |
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a**********m
发帖数: 2098 | 36 Santa Clara
coz you wanna practice IP and stay in Bay Area
Or you may ask UC Davis to see if they'd like to give you more money than Sa
nta Clara before you turn down the admission
the
some |
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a**********m
发帖数: 2098 | 37 斗胆猜一个，你要申请的是Santa Clara吗？
建议你还是先体验一下公司内部做IP的是什么感觉再考虑是否要转行。如果内部转到IP
部，还能与外面的律师打些交道，对所里的工作内容和状况也多少有所了解。看你现在
的描述，基本都是在外行看热闹的阶段，怕你法学院读上几年，投入了时间和精力后才
发现后悔。而且这年头，不是名校读出来且毫无IP经验的JD，在IP job market上基本没
有竞争力。你的专业背景可能会稍微帮下忙，但是作用有限。当然，如果是在硅谷读Sa
nta Clara，那就业前景会好一些。
坦白地讲，你现在如行有点晚了。早10年的话说不定就是条金光大道了。
sue |
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t*******t
发帖数: 369 | 38 I'm attending the NTA conference in Florida on Nov. 19.....
2005 |
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