j********2
发帖数: 10 | 1 We are a National Tour Association (NTA) member doing event planning and
MICE/leisure travels. We have a vacancy of tour operator/event planner in
our office within blocks to McCormick Place, Chicago.
Job responsibilities:
- Event planning and implementation;
- Travel operations such as itinerary design, hotel/transportation/
restaurant reservation, tour guides/drivers/interpreters dispatch, paperwork
preparation, office support, vehicle management, etc.;
- Supplier management and relationship m... 阅读全帖 |
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j********2
发帖数: 10 | 2 Job Description2: Project Managers
Will be able to create, design and manage Chinese professional training
programs and Student Summer Programs, and to coordinate with travel and tour
operators and office admin. Currently projects include Environmental and
Safety Control Program (ESCP), Ethic Training and Corruption Prevention
Program (ETCPP), and Student Art of Science Summer Camp (SASSC)
Qualifications:
1. Being eligible to work in the US
2. Have strong project development skills with cr... 阅读全帖 |
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j********2
发帖数: 10 | 3 Destination Management Company is recruiting Business Travel and Leisure
Tour Operators & Project Manager
Job Descriptions (full time, part time or internship):
Business travel and leisure tour operations, Customer relationship and
Supplier management & office admin.
Qualifications:
Being eligible to work in the United States, but not necessary for the
excellent candidates, Chinese from Hong Kong and Taiwan are encouraged to
apply
Bilingual is necessary: Native Chinese speaker with excellent Eng... 阅读全帖 |
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c*****g
发帖数: 31 | 4 老牌旅行社因业务繁忙，需聘请粤语销售2名
岗位职责：
1. 机票、旅游产品销售
2. 接待上门客户，协助处理解答客户疑问
任职资格：
1. 有合法工作身份。
2. 熟悉运用电脑及办公软件
3. 中英文读写流利，粤语听说流利
4. 能够独立操作多项任务
5. 无需工作经验
应聘方式：投送您的简历至邮a class="__cf_email__" href="/cdn-cgi/l/email-protection" data-cfemail="9d793e27f5efddfefef5e9eff4edb3fef2f0">[email protected]/* */ 不接受无预约上面及电话咨询
彩虹之旅国际旅行公司于2000年成立于在美国东部最繁华的城市--纽约，在中国、美国
洛杉矶、德国汉堡均设有办事处。公司为国际航空运输协会(IATA)、国际正式邮轮组织
(CLIA)、旅游协会NTA 等机构注册会员，并被评为目前美国最具实力的旅游公司之一。
作为全球华人国际旅行的领导品牌，彩虹之旅始终秉承着“您想不到的，我们替您想到
；您能想到的，我们替... 阅读全帖 |
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u*****a
发帖数: 6276 | 5 侨报记者宋旸7月22日纽约报道】夏季旅游进入旺季，旅行期间若遇到突发情
况而耽误行程十分令人扫兴。时有华人遇到黑导游投诉无门，谁知家住布碌仑康尼岛的
旅行社导游吴先生，却被行内人黑了一把。22日，吴先生到《侨报》投诉，大呼上当。
吴先生表示，自己在纽约做包车业务。近期先后招收2名导游为自己打工，谁
知在带客人游玩一天后，两位导游均人间蒸发，将客人扔在酒店，把收到的现金一并卷
走，前后损失超过10000元。
吴先生与记者来到其驻地，拿出出走导游的身份证复印件，他怎么也想不明白
，为何会发生这样的事情。他表示，因为近些年中国赴美旅游人数激增，因此公司业务
越做越大，一个人做分身乏术，便在网上以司机兼导游的形式招聘合作人。
“合作形式是由我来提供客户资源，导游负责大陆旅游团的交通接送，景点游
览以及门票。客人到达首日现金支付团费，当日接待后由导游收取现金，然后利润7/3
分账。”吴先生说，“开始几次合作非常愉快，每次客人结帐后导游都第一时间将现金
交到我这里，我即刻将利润给导游。”
但随后的一次接团便出了问题，吴先生表示，由于... 阅读全帖 |
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B*D
发帖数: 5016 | 6 草根牛博操控者
2011-04-29 19:52:17 采访/本刊记者 卢山林 卢旭成 刘建强 饶宇锋文/本刊记者 卢旭
成 编辑/卢山林
你在玩微博，微博在玩你。那些上百万粉丝的草根微博背后是谁？谁在瓜分那些著名的
微博账号？如何在微博上快速赚钱？《创业家》独家解密微博生意经和微博势力关系谱
。
你在玩微博，微博在玩你。微博装饰了你的生活，你装饰了别人的梦。
据《创业家》杂志调查采访，新浪草根微博排行榜前50名中，有一半属于“福建帮”，
杜子建、“酒红冰蓝”各拥有十几个。
“冷笑话精选”——新浪微博草根榜第一名，粉丝3091529（截至2011年4月22日），直
逼《参考消息》——这份中国发行量最大的报纸的发行量。幕后博主尹光旭是个85后，
福建人，除去“冷笑话精选”，他还拥有另外3个过百万粉丝的微博。
尹光旭不是一个人在战斗，背后是一个庞大而隐秘的“微博福建帮”。天使投资人、号
称“站长之王”的蔡文胜不仅是尹光旭的投资人，同时也是新浪微博江湖中控制粉丝数
量的第一人。一位从事微博营销行业的资深人士称，蔡文胜拥有的账号至少控制了1/8新
浪微博用户，而蔡的一位同行告诉《创业家》，蔡旗... 阅读全帖 |
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f*******d
发帖数: 637 | 7 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: brihand (brihand), 信区: Military
标 题: 诺基亚亏损积重难返：大中国区销售额骤降70%
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Apr 19 21:06:16 2012, 美东)
诺基亚亏损积重难返：大中国区销售额骤降70%
http://www.sina.com.cn 2012年04月20日 02:20 新浪科技微博
新浪科技讯 4月20日凌晨消息，昨日晚间，诺基亚发布了2012财年第一季度财报，
数据显示，一季度净营收为73.54亿欧元，同比下滑29%，净亏损9.29亿欧元，这是诺基
亚自2011年以来连续四季度财报出现亏损。从财报分析来看，诺基亚的智能手机战略转
型并没有效果，智能手机的亏损更加严重。中国市场销售额骤降70%。这些都让人感到
，诺基亚积重难返，危机重重。
诺基亚连续四个季度出现亏损
刚发布的诺基亚2012财年第一季度财报显示，一季度净营收为73.54亿欧元，同比
下滑29%。净亏损9.29亿欧元，而上年同期净利润3.44亿欧元。
2011年的第一季度财报让诺基亚感到了... 阅读全帖 |
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b******i
发帖数: 4776 | 8 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: brihand (brihand), 信区: Military
标 题: 诺基亚亏损积重难返：大中国区销售额骤降70%
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Apr 19 21:06:16 2012, 美东)
诺基亚亏损积重难返：大中国区销售额骤降70%
http://www.sina.com.cn 2012年04月20日 02:20 新浪科技微博
新浪科技讯 4月20日凌晨消息，昨日晚间，诺基亚发布了2012财年第一季度财报，
数据显示，一季度净营收为73.54亿欧元，同比下滑29%，净亏损9.29亿欧元，这是诺基
亚自2011年以来连续四季度财报出现亏损。从财报分析来看，诺基亚的智能手机战略转
型并没有效果，智能手机的亏损更加严重。中国市场销售额骤降70%。这些都让人感到
，诺基亚积重难返，危机重重。
诺基亚连续四个季度出现亏损
刚发布的诺基亚2012财年第一季度财报显示，一季度净营收为73.54亿欧元，同比
下滑29%。净亏损9.29亿欧元，而上年同期净利润3.44亿欧元。
2011年的第一季度财报让诺基亚感到了... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 9 我是刚换了工作。之前H1b原本是今年八月满三年。八月之前新单位提交了新的H1b申请
，目前还在pending状态。
I94应该是和之前老雇主H1b关联的，应该是今年八月到期了。
请问这种情况下如果新的H1b被拒，会收到NTA吗？收到被拒信之前，算是身份非法吗？
需要立刻离境吗？
目前应该怎么做才是最合理的选择呢？辞职回国，将来国内申请H4?
谢谢 |
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a****r
发帖数: 4965 | 10 你上一个H1B I-94已经过期了，现在是H1B Pending的状态，要等H1B批准了才能转身份
。所以想和你老公H1B一起申H4，需要拿到新的H1B I-94。
因为你你上一个H1B I-94已经过期了，万一H1B延期悲剧，你没有合法身份在美国，有
可能收到NTA，但H1B延期悲剧之前是合法在美国，悲剧后要尽快离开美国，再签H4回来。 |
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w***n
发帖数: 193 | 11 一
大神你说的是法律规定的情况
F1直接 485肯定要完了是吧 本版很多这种吧 H1b延期被拒 或者转雇主被拒也是马上
死吧
另外 进入NTA 移民法庭案件积攒好几年排期了 这个期间申请人不能出境否则10年禁止
入境 可境内等着又没有合法身份算unlawful presence 而且不能工作 不能中间离境
这算不算座监狱无期徒刑 如果最后移民法官判据合法，这几年等待的时间算非法拘留
，有是几年不能入境
以前本版问了很多的USCIS因为它自己愚蠢错误据了485的 以前还可以再投一份 现在如
果没有同时保持H1B身份 那就别无选择 直接离开美国永远不能再回来了吧，CP是不是
也因为这个bar不可能了呢？
485 |
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f*******n
发帖数: 12623 | 13 不要申请身份延期。B2身份延期要附上声明说他们有什么打算离开。他们不打算离开，
所以要说谎。而且如果延期被拒，要33天内离开，否则会给NTA，开始进行驱逐出境程
序.
他们最好黑在这里一直到你入籍，跟着申请绿卡。他们申请绿卡是不需要有身份；黑多
久无所谓。 |
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S**I
发帖数: 15689 | 14 You're right, it's nothing new. Some illegal immigrants (most from Mexico)
just go to local USCIS office to report their status, and receive a NTA (
notice to appear) for immigration court session --- which decides whether
they will be deportable or not. Then they can apply for EAD and work legally
in the US until the court makes the final decision, which may take years. |
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w***n
发帖数: 193 | 15 好好一个学术讨论版面，被你们这几个疮粪过来搅局，搞成和美新版一样恶臭了。
英文看不懂，法律说不出，除了人身攻击谩骂还会干吗？
你们这几个疮粪继续忽悠大家，忽悠的大家都觉得疮普新政没有危害，不做预防准备，
然后哪天直接没用RFE NOID前提下直接拒信加NTA，你们这些疮粪就达到白人至上的目
的了吧。可惜即使我们留不下，被疮普新政迫害，你们也别以为你个黄皮就能在疮普的
美国有好日子过，也许最后结果比我们还要惨。 |
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d********f
发帖数: 43471 | 16 你这个阶段不是应该欢欣鼓舞么，eb1年年不到4月就用完，说明通过率节节高，eb2,
eb3 不停倒退也说明发卡越来越快阿，如果像某些精神病说的一样，nta满天飞，难道
不是应该大家马上都current了么，这不用考过gre，能考过sat就能理解阿 |
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发帖数: 1 | 17 关它djt什么关系？你是阅读有障碍吗？说nta呢，而且为什么不说，申请人数和倒退的
关系。想转移话题呀？ 把你的数据拿出来，证明之间关系，不然就是胡说八道
: 醒醒啊，老川都干了快2年总统了
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c***i
发帖数: 206 | 19 Organizer: 美中华人康体文娱联会
Our indoor season starts this Saturday at the NTA gym shown in the attached
map. We have 19 games in totally between 11/05/10 - 03/31/11, excluding
holidays.
Playtime: 10:30am - 12:30pm (will change in January to 9am - 11am)
Payments:
Season pass is $80, which gives you access to all 19 games.
Pay-as-you-play: $8/game.
Late-fee deposit: $20.
Late-fee rules:
If you are on time or less than 10 minutes late, no late fee.
10 minutes- 30 minutes late, $1 late fee.
30 minutes -... 阅读全帖 |
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B*D
发帖数: 5016 | 20 因为你申请庇护589面谈的时候，你是有F1身份的
所以庇护失败后，你还是F1身份
并不会进入递解程序的NTA打庭
你现在回国签证，理论上和普通f1回国再签证过来是一回事情
你应该问一下这里的很多靠庇护生存的移民律师
这些律师素质不高，但是这些问题，他们靠经验应该还是可以回答
到这个板上来，纯粹自己找misinformation/disinformation |
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G***Y
发帖数: 9698 | 21 华人无照导游被骗万元吃闷亏
发布于 2014-07-23, 周三 00:52
【侨报记者宋旸7月22日纽约报道】夏季旅游进入旺季，旅行期间若遇到突发情
况而耽误行程十分令人扫兴。时有华人遇到黑导游投诉无门，谁知家住布碌仑康尼岛的
旅行社导游吴先生，却被行内人黑了一把。22日，吴先生到《侨报》投诉，大呼上当。
吴先生表示，自己在纽约做包车业务。近期先后招收2名导游为自己打工，谁
知在带客人游玩一天后，两位导游均人间蒸发，将客人扔在酒店，把收到的现金一并卷
走，前后损失超过10000元。
吴先生与记者来到其驻地，拿出出走导游的身份证复印件，他怎么也想不明白
，为何会发生这样的事情。他表示，因为近些年中国赴美旅游人数激增，因此公司业务
越做越大，一个人做分身乏术，便在网上以司机兼导游的形式招聘合作人。
“合作形式是由我来提供客户资源，导游负责大陆旅游团的交通接送，景点游
览以及门票。客人到达首日现金支付团费，当日接待后由导游收取现金，然后利润7/3
分账。”吴先生说，“开始几次合作非常愉快，每次客人结帐后导游都第一时间将... 阅读全帖 |
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l******l
发帖数: 2651 | 22 Source:
http://timesofindia.indiatimes.com/world/us/Duped-Indian-studen
>>>>
WASHINGTON: Hundreds of Indian students who have gotten scammed by a dodgy
California-based university had it coming. Tri-Valley University (TVU) had a
reputation as a "Diploma Mill" that offered a spurious route to employment
and immigration in the US. Inquiring students and professionals knew about
it, discussed it in immigration forums, and warned others about it.
But eager beavers looking for a short cut to emigrati... 阅读全帖 |
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m**o
发帖数: 9805 | 23 travel is cool now... lol
人家都走到联盟改规则了，空前肯定，绝后不一定
今年已经带动跑步队了，下赛季说不定就带动全联盟了
再连庄一下NBA就改名NTA了 |
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h******d
发帖数: 4761 | 25 找到了这个视屏的出处，以及实验的机构等信息。
本人没有任何立场，大家仅供参考。
（估计版上认得瑞典语的不多，故用google 翻译）
http://translate.google.com/translate?hl=en&sl=sv&tl=en&u=http%
page 3 第一个帖子
Thanks for all the comments. Testet av älgstudsare har utförts av FMV (Försvarets Materialverk) i Karlsborg, ett av världens främsta vapenlaboratorier.
The test of älgstudsare carried out by FMV (Defence Materiel Administration) in Karlsborg, one of the world's leading weapons laboratories.
Testfakta anlitar alltid oberoende... 阅读全帖 |
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m*******e
发帖数: 71 | 26 一个朋友的朋友最近负责成立了一个GA 商业俱乐部和学校，客源充足稳定。想在美国
找合作伙伴，要求：
在美国的GA 行业有信誉；
专长服务与品牌产品（不限飞行学校和俱乐部）
愿意进入中国市场，但还没有代理/代表在中国。
希望是在知名州，如：CA， TX， FL 等等
AOPA， HAI， NTA 等的会员。
有哪位专家能否给提供些信息？感谢万分。 |
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发帖数: 1 | 27 随着美国对外签证政策的放宽，越来越多的中国游客选择去美国旅游。对于想去美国旅
游却苦于没时间做攻略的朋友来说，选择美国当地的华人旅行社跟团游，省事又省心。
一般在美国当地参加华人旅游团，无押金、无强制消费，相对国内组团更加自由和人性
化。但是目前华人旅行社非常之多，那么美国华人旅行社哪家好呢？小编通过多方面了
解到的目前评价比较好的华人旅行社公司相关资质 ，在这里为大家奉上美国华人旅行
社最佳排名，希望对大家出游选择有所帮助。
旅行社介绍
星级
评论
美国纳美旅行社 （http://www.aotrip.net/）
总部：纽约
经过严格的审核与全方位的资质评估，纳美旅游已经成为了IATA（国际航空运输协
会），ARC（航空公司授权开票商），NTA（国际旅游协会），ASTA（美国旅游协会）以
及CLIA（国际正式游轮组织）的会员，同时为客户提供五百万美元的旅游保险，点击旅
游专业责任保险证书。纳美旅游与多家国际航空公司有着良好的合作关系和密切的业务
往来，现已成为美国知名度最高的国际旅行社之一。
☆☆☆☆☆
行业历史悠久操作经验丰富，在美国东部海岸旅游供应商中属于翘楚。总部设在纽约，
主... 阅读全帖 |
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z*********e
发帖数: 10149 | 29 一共就26个
https://github.com/mandatoryprogrammer/NorthKoreaDNSLeak
airkoryo.com.kp.
cooks.org.kp.
friend.com.kp.
gnu.rep.kp.
kass.org.kp.
kcna.kp.
kiyctc.com.kp.
knic.com.kp.
koredufund.org.kp.
korelcfund.org.kp.
korfilm.com.kp.
ma.gov.kp.
masikryong.com.kp.
naenara.com.kp.
nta.gov.kp.
portal.net.kp.
rcc.net.kp.
rep.kp.
rodong.rep.kp.
ryongnamsan.edu.kp.
sdprk.org.kp.
silibank.net.kp.
star-co.net.kp.
star-di.net.kp.
star.co.kp.
star.edu.kp.
star.net.kp.
vok.rep.kp. |
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R*o
发帖数: 3781 | 30 3:24 Though all men without distinction are sinners, they may be justified (
dikaiouvmenoi, dikaioumenoi), that is, declared righteous and freed from all
charges in connection with their sin (Rom 5:1). This is not a reference to
being made righteous in any ethical or spiritual sense, but rather to a genu
ine legal pronouncement involving acquittal (cf. Rom 3:8). And God pronounce
s a person justified freely (dwreavn, dorean) by his grace. The idea of “fr
eely” reaches back to Paul’s comment in 3... 阅读全帖 |
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R*o
发帖数: 3781 | 31 3:24 Though all men without distinction are sinners, they may be justified (
dikaiouvmenoi, dikaioumenoi), that is, declared righteous and freed from all
charges in connection with their sin (Rom 5:1). This is not a reference to
being made righteous in any ethical or spiritual sense, but rather to a genu
ine legal pronouncement involving acquittal (cf. Rom 3:8). And God pronounce
s a person justified freely (dwreavn, dorean) by his grace. The idea of “fr
eely” reaches back to Paul’s comment in 3... 阅读全帖 |
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R*o
发帖数: 3781 | 32 4:3 Picking up on the question of whether Abraham was justified by works (wh
ich some Jews held), Paul says: this is not what the scripture teaches. It t
eaches in Genesis 15:6 that Abraham believed God and it was credited to him
as righteousness (ejpivsteusen deV jAbraaVm tw'/ qew'/ kaiV ejlogivsqh aujtw
'/ eij" dikaiosuvnhn, episteusen de Abraam to theo elogisthe auto eis dikaio
sune). In other words, Abraham was declared righteous by believing God conce
rning the promise for many descendants ... 阅读全帖 |
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R*o
发帖数: 3781 | 33 6:8-10 The point of vv. 8-9 is this: if we have died with Christ we will cer
tainly live with him since he died to death once and for all, it can, theref
ore, never hold sway over him again and subsequently he lives to God.
What does Paul mean when he says, “we…will live” with him (v. 8)? Is he t
hinking about our present experience as Christians, or is he thinking about
the future? This is essentially the same question we faced in v. 5. Some sch
olars argue that the future tense points to the t... 阅读全帖 |
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d******e
发帖数: 4192 | 34 //印顺法师有文章谈论这个,你的观点来自他的观点.
//所以我才问你,这是一个学术观点吗?
【妙 云 集】
印顺法师文集
七、楞伽经编集时地考
楞伽经为真常唯心论的要典，他的编集流通，应当在笈多王朝的盛世。这可从几方面说
明：一、本经引述到『胜鬘经』；「缚象与大云，央掘摩利罗」经；唐、魏二译及梵本
，更叙述到『大涅盘经』。『涅盘经』中糅有『大毘婆沙论』文，『婆沙』为公元二世
纪末的作品。偈颂品说到龙树的住持佛法，龙树为公元二、三世纪人。所以本经的编集
，总在三世纪以后。
再从本经所叙政教的情势而论，编集于笈多王朝，这是可以断言的。在政教形势的
叙述中，有一非常的异义，即以佛为迦旃延氏，以释迦为后起的，把他看作数论、胜论
的流类。宋译阙颂品，且据唐译来解说。佛姓迦旃延氏，有二则。一说：「我姓迦旃延
，净居天中出，为众生说法，令人涅盘城。……色界究竟天，离欲得菩提」。这是色究
竟天成佛的。二说：「我名离尘佛，姓迦多衍那，父名世间主（魏译作梵天主），母名
为具才。我出瞻波城，我之先祖父，从于月种生，故号为月藏」。他名为离尘垢佛，还
有一文，如说：「我在于林野，梵王来惠我，鹿皮三歧杖，膊绦及军... 阅读全帖 |
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t******g
发帖数: 17520 | 35 非我(上篇)
Posted on 2016 年 05 月 03 日 by 學文
(朱倍賢老師開示於2016年3月20日)
現在有很多普遍地對於「非我」(anātta/anātman)此一話題的誤解。此篇分上下兩部
分講述「非我」的觀念。
佛陀講「非我」的動機是為了長夜安樂之道，不是在描述實相或本體論
佛陀在講「非我」這個議題時，起始動機和用意不是在探索所謂的實相，或探索宇宙人
生最高、最終的本體論上的真理。與其去討論本體上終究的本質是什麼，到底是人性本
惡、還是人性本善，到底是性空、唯識，不如去討論，行為與痛苦間的關係。這就是回
歸到佛法最原始的「業力」的學說。不斷地看到在起心動念、活動方式的層面上，什麼
才是有幫助的。
所以，當佛陀講「我」或「非我」的議題時，不是在講一個東西「存在」、「不存在」
。他討論的「我」與「非我」，基本上是兩種不同的活動模式。原始佛經裡，很多時候
佛陀在講「我」時，用的是很特殊的表達法：“I-making”、“mine-making”。意思
就是「架構自我、架構我所」的活動。同樣地，「非我」是某種對待事物的態度和活動
方式。
「自我」的其中一種活動方式，就是... 阅读全帖 |
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A****S
发帖数: 978 | 36 【 以下文字转载自 Overseas 讨论区,原文如下 】
发信人: mikicn (米米), 信区: Overseas
标 题: 9月29日CJ惊魂记：
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Wed Oct 1 18:52:05 2003) WWW-POST
9月29日CJ惊魂记：
首先申明，所有经历属实，但不相信的人不必看，我不想浪费你的时间，也不想解释我并
没有虚构。写东西对于我没有任何好处，而且我写中文速度很慢，我只希望给别人一个参
照，不喜欢者勿看。
我是和我BF一起去的，9月27日早上从ALABAMA出发，9月28日下午开车到EL
PASO，晚上在梁老板处遇见各位签友，大家交流了一下经验。第二天开车到SA
NTA FE
桥，停车过桥。过桥很顺利，没有任何问题。到了后去BANK交钱，也没有问题。然后去EM
BASSY，
常规检查后就是等待。我的APPOINTMENT是10AM，但我等到近一点才等到面试。VO非常冷
淡，没有任何笑以，问我一些常规问题（诸如UNIVERSITY，MAJOR，RESEARCH
AREA）后就给我一张表格填，表格是关于个
人情况， |
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l*********u
发帖数: 19053 | 37 zz
据中国中车消息，11月27日下午，以色列特拉维夫都会区公共运输有限公司（NTA）宣
布，将向中国中车长客股份公司采购120列100%低地板轻轨车辆，装备特拉维夫市第一
条城市轨道交通线路。这是中国轨道交通装备企业在以色列面向全球的招标中首次胜出。
中车长客股份公司与包括阿尔斯通、西门子、庞巴迪、卡夫在内的全球10家轨道交
通装备制造企业经过激烈竞争，最终中标。
该项目全部标的除了120列100%低地板轻轨车辆，还包括16年的车辆检修维护。据
了解，这也是中车长客检修维护服务出口年限最长的项目。
为了满足以色列的特殊政治环境，车辆堪称轻轨车中的“反恐精英”，采用防爆设
计。技术条件参照了高铁标准，是一款高档轻轨车辆。
该项目于2012年11月9日面向全球招标，经过3次延标，于2014年6月30日正式开始
投标，中车长客股份公司与包括阿尔斯通、西门子、庞巴迪、卡夫在内的全球10家轨道
交通装备制造企业经过激烈竞争，最终中标，值得一提的是，中车长客股份公司的技术
和商务得分都是第一，特别是技术方案中，每个评分点都是最高分。
该项目线路全长约23公里、23个站台，其中11.5公里为... 阅读全帖 |
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r****o
发帖数: 105 | 38 跑跑western，用anti-His-tag 抗体看看有没有蛋白。另外Ni-NTA与his-tag
的结合非常不特异。你biacore的结果其实不可信。
很难相信300mM的imidazole还洗不下来.我觉得要么是根本没有蛋白表达
，或者没结合上去。如果是后者，你检查一下你的Ni beads是不是好的。 |
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i******k
发帖数: 4625 | 39 测原子光谱可行不？
BTW, 难道不能简单的试试NTA-Ni resin? |
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g****u
发帖数: 1422 | 40 这是个好方法，我在考虑能不能用个label system直接在SDS-PAGE上做标记。查了一下
最近有这方面的研究，有种Ni-NTA-Cy3可以用来labeling |
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m**********2
发帖数: 6568 | 42 there are lots of proteins with multiple His residues. they bind to Ni-NTA.
道lysozyme没被洗掉吗？按理lysozyme不应该结合Ni柱啊，难道lysozyme粘住我要的蛋白 |
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e****s
发帖数: 1125 | 44 pull down 有点问题才想换个方法试试看。
用NTA-Ni能成功的pull down目标蛋白，但改成同位素标记的目标蛋白以后，就搞不定了，信号/
噪音比很差很差。
有什么好建议和分析吗？ |
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e****s
发帖数: 1125 | 45 I see.
I cleaned up the samples by ultracentrifuge at 100,000rpm for 30 mins (
without sucrose) following by gel filtration to remove free labeled AAs.
the problem is the pulldown assay signal is very low. I may try both NTA-Ni
pulldown and IP to see which condition give me a better result.
bottom |
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s********n
发帖数: 2939 | 46 理论上可以这样：
构建两个带有不同purification tags而且可以相容的载体，如6xHis tag on pET和
Strep tag on p15A or dual vector。让这两个monomer coexpress，用Ni-NTA和Strep
tag的亲和柱顺序纯化即可。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 47 我觉得如果你的蛋白能够用Ni-NTA column纯化说明N端的His-tag没问题，很大可能是
翻译提前终止或者降解了。如果是翻译提前终止的话，可能是稀有密码子的缘故，你可
以试试一些带有稀有tRNA的菌株，如Rossetta系列，也可以直接合成codon optimized
的基因。如果是降解的话需要分析一下是in vivo还是in vitro，in vivo很麻烦，可能
要换菌株，in vitro的话可以在做cell lysis的时候加protease inhibitors. |
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s******e
发帖数: 1073 | 48 NI-NTA 和 Talon mental beads 相比， 纯化的效果那个好些？
谢谢！ |
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l*****m
发帖数: 98 | 49 1, the sample you get will be those proteins without histine tag. the his-
tagged protein only comes out when you wash them with imidazole
2, i think they will still have the activity if it is folded
3, i donot know. |
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