g******n
发帖数: 53185 | 1 你这个干爹的笑话不如这个亲爹的好笑
几年前沉迷魔兽，还带过PFU团，团里有个圣骑士意识和态度很好，一直全勤。所以聊
的比较多。
我一般不去参加公会聚会，听说他唱带着大伙儿吃鱼翅泡饭，FD之后半夜还常组团去腐
败，大伙儿都说太子党。
他是个单亲家庭的孩子，经常和我诉苦。大学才毕业，他爹是做大买卖的，一年到头最
多只有三四天在家，特别孤苦。
他爹呢，一直觉得，这么多年这孩子有爹没娘的。作为富二代，成绩也不错，除了打打
游戏上上猫扑也没有不良嗜好。孩子越大越觉得愧疚。
这哥们青春期之后，就经常在自己家里开party，请一群同学、猫扑网友之类的来玩儿
，富豪嘛，自然是住别墅。有一次他爹突然回家，看到一大群少男少女吓了一跳。
他这群常来玩儿的朋友里，有一个女孩子小A，和他私交很好，比他还小一岁，人长的
很漂亮，性格也很不错。只是朋友，他一直也没固定女友。来得多了，和他爸也见过几
次。也换了联系方式，他叛逆期之后，他爸就经常通过这个女孩子，了解他儿子的近况
。
前年年底，他QQ上跟我说，他爹再婚了，就是和小A…
我五雷轰顶，问他：你爹现在带着小A满世界跑生意？
他说：我后妈跟我一起住，我爹说了，他... 阅读全帖 |
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p*******n
发帖数: 4824 | 3 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: everlast (打倒验证码!), 信区: Joke
标 题: 这个故事让我无语到崩溃 （转自豆瓣）
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 12 22:28:35 2011, 美东)
这个故事让我无语到崩溃 （转自豆瓣）
几年前沉迷魔兽，还带过PFU团，团里有个圣骑士意识和态度很好，一直全勤。所以聊
的比较多。
我一般不去参加公会聚会，听说他唱带着大伙儿吃鱼翅泡饭，FD之后半夜还常组团去腐
败，大伙儿都说太子党。
他是个单亲家庭的孩子，经常和我诉苦。大学才毕业，他爹是做大买卖的，一年到头最
多只有三四天在家，特别孤苦。
他爹呢，一直觉得，这么多年这孩子有爹没娘的。作为富二代，成绩也不错，除了打打
游戏上上猫扑也没有不良嗜好。孩子越大越觉得愧疚。
这哥们青春期之后，就经常在自己家里开party，请一群同学、猫扑网友之类的来玩儿
，富豪嘛，自然是住别墅。有一次他爹突然回家，看到一大群少男少女吓了一跳。
他这群常来玩儿的朋友里，有一个女孩子小A，和他私交很好，比他还小一岁，人长的
很漂亮，性格也很不错。只是朋友，他一直也没固定... 阅读全帖 |
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a***k
发帖数: 1038 | 4 "airborne spread among humans is strongly suspected" per Public Health
Agency of Canada.
"if a symptomatic patient with Ebola coughs or sneezes on someone, and
saliva or mucus come into contact with that person’s eyes, nose or mouth,
these fluids may transmit the disease" per CDC.
Ebola worse than HIV, SARS per the man leading the UN response to the Ebola
epidemic, Dr. David Nabaro.
According to the Center for Aerobiological Sciences, U.S. Army Medical
Research Institute of Infectious Diseases a... 阅读全帖 |
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a***k
发帖数: 1038 | 5 According to the Center for Aerobiological Sciences, U.S. Army Medical
Research Institute of Infectious Diseases at Fort Detrick, Maryland:
(1) Ebola has an aerosol stability that is comparable to Influenza-A
(2) Much like Flu, Airborne Ebola transmissions need Winter type conditions
to maximize Aerosol infection
"Filoviruses, which are classified as Category A Bioterrorism Agents by the
Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, GA), have stability in
aerosol form comparable to other ... 阅读全帖 |
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a***k
发帖数: 1038 | 6 "airborne spread among humans is strongly suspected" per Public Health
Agency of Canada.
According to the Center for Aerobiological Sciences, U.S. Army Medical
Research Institute of Infectious Diseases at Fort Detrick, Maryland:
(1) Ebola has an aerosol stability that is comparable to Influenza-A
(2) Much like Flu, Airborne Ebola transmissions need Winter type conditions
to maximize Aerosol infection
"Filoviruses, which are classified as Category A Bioterrorism Agents by the
Centers for Disease ... 阅读全帖 |
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r*******y
发帖数: 672 | 7 感谢 zooropa KittyGray quondam Older frada widereceiver Hower junma66 PFU
留言
谢谢你们的鼓励和建议 ：） |
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r*******y
发帖数: 672 | 8 感谢narakavala xlyytchy childheart littlelonely kangte baichichi
cadenzasong musiclOa aba25 Remembrance abbadozju supercat123 lingge stll
jazzcat letwave cadgn aside xianghuihui PFU aixiaojiajia sanduoo lisary
blueraindrop almeda cdefgab hikingboy 留言和鼓励
baichichi 哈哈 你太逗了 我想解释一下此歌无毒无副作用的 而且环保。。。
aba25 没有保养的 其实我很多纯净的歌是装嫩的 呵呵
abbadozju 这个编曲确实挺特别的 很流畅的感觉 光是听伴奏就挺好听
supercat123 lingge 武侠歌是我大爱 哈哈
stll 咦？？ 你怎么也在这儿？？ |
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d*****u
发帖数: 17243 | 9 生 普通话是翘舌，陕西话是平舌，并不一样
这个字在河南山东等北方大部都是平舌，只有北京是翘舌
水读fei之类的是西北普遍现象
西安附近一些地方“出”读成pfu才是特色（pf连起来）
还有“软”读成van |
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U***5
发帖数: 2796 | 10 http://www.amazon.com/review/R22LIB1HMUDXPB/ref=cm_cr_dp_cmt?ie
Posted on Jan 24, 2013 12:57:20 PM PST
Last edited by the author 10 hours ago
Ping Fu says:
Lin, I welcome your constructive feedback, but it looks like you didn't even
read the book. I also welcome you to have a direct dialog with me.
Obviously that you care about truth and facts, I do too. So I welcome you to
email me at p*[email protected], and I'd be happy to talk to you and to
address many of your questions. It seems that you and ... 阅读全帖 |
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e******t
发帖数: 457 | 11 这个故事让我无语到崩溃 （转自豆瓣）
几年前沉迷魔兽，还带过PFU团，团里有个圣骑士意识和态度很好，一直全勤。所以聊
的比较多。
我一般不去参加公会聚会，听说他唱带着大伙儿吃鱼翅泡饭，FD之后半夜还常组团去腐
败，大伙儿都说太子党。
他是个单亲家庭的孩子，经常和我诉苦。大学才毕业，他爹是做大买卖的，一年到头最
多只有三四天在家，特别孤苦。
他爹呢，一直觉得，这么多年这孩子有爹没娘的。作为富二代，成绩也不错，除了打打
游戏上上猫扑也没有不良嗜好。孩子越大越觉得愧疚。
这哥们青春期之后，就经常在自己家里开party，请一群同学、猫扑网友之类的来玩儿
，富豪嘛，自然是住别墅。有一次他爹突然回家，看到一大群少男少女吓了一跳。
他这群常来玩儿的朋友里，有一个女孩子小A，和他私交很好，比他还小一岁，人长的
很漂亮，性格也很不错。只是朋友，他一直也没固定女友。来得多了，和他爸也见过几
次。也换了联系方式，他叛逆期之后，他爸就经常通过这个女孩子，了解他儿子的近况
。
前年年底，他QQ上跟我说，他爹再婚了，就是和小A…
我五雷轰顶，问他：你爹现在带着小A满世界跑生意？
他说：我后妈跟我一起住，我爹说了，... 阅读全帖 |
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b*******s
发帖数: 5216 | 12 工业上一般毫秒级就算很好了，的确很少这类低延迟系统。真有这种精确时间要求的话
，一般要单独做板子，计时晶振什么都是单独做的，还要有消除累积误差的电路，因为
软件是依赖硬件时钟的，很难消除各种硬件误差，以前我们就遇到过日本pfu做的板子
的计时不精确的问题。一般工业上的实时不是指低延迟，就是任务实时截止和实时调度
，该停的马上停，该工作的马上工作，一般就是看中断响应速度，以前赵策就是搞不懂
这个，老闹笑话 |
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a***o
发帖数: 129 | 13 not really, you have actually same # of steps as 2-step PCR
One step: PCR----DpnI-----Self ligation
two step: PCR----PCR---TA cloning
And actually your steps are more tricky, if you consider that Pfu has low
processivity while you have to PCR the full length of the plasmid which is at
least 3kb, you didn't really save time; and also compared to the efficiency
of 2-step which is 100%, the efficiency of your method is low; another
consideration may not be so important to you. you have to buy ex |
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a***o
发帖数: 129 | 14 Good point. OK, this is the best-kept secret of the century, hehe. The truth
is I always do my first round of PCR with Pfu (Pfx from invitrogen seems to be
quite efficient). If not for ease of cloning I will do second round with it
too. But since the fragment you want to mutate is usually around only 1 kb,
taq will be good enough.
Another reason I prefer Pfx in first round is that Taq should introduce an
overhang at the end of the product, sometimes this maks you troube in second
round by introd |
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g***m
发帖数: 465 | 15 其实没必要控制cycle，虽然书上这么建议的。
俺先后用过两个proofreading，先是用NEB的Deep Vent,这个酶的忠实度狠好，俺用来构
建质粒，35cycles,将近1k的三个片段拿去测序，没有错误。
后来作RT PCR的时候因为template是total poly A RNA，而Deep Vent没有Hot start，结
果不是太consistant，有时候有，有时候没有，产率也偏低。俺就换到Pfx plantium
(Invitrogen)，号称市面上忠实度最高的，现在所有RT PCR都作出来了，35cycles,3K的
片段。先拿了一个基因的三个克隆测序，结果是在两端大致1.5k的长度上DNA序列有2-4个
错误，氨基酸序列没有错误。而且由于俺同时测了三个克隆，以后可以用没有错误的克隆
拼接成error free的一个全长片段。
总的来说，Mg的浓度不要太高，酶的用量要尽可能少，然后就是wait and pray了，呵和
。
好运！ |
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r****o
发帖数: 105 | 16 1 design primers of ~30 bp length.
2.Use good polymerase to do PCR (herculase from stratagene is great,
a Pfu with special buffer in it to increase the fidelity)
3. add 1~3 ul Dpn I directly to the PCR reaction tube. digest it
for at least 3 hours in 37 degree
4.Desalt the PCR sample with PCR purification kit from Qiagen.
5.Transform competent E.Coli.
6. Pick up several colonies , grow small cultures and do miniprep.
7. Send the DNA to sequencing. |
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r****o
发帖数: 105 | 17 1 design primers of ~30 bp length.
2.Use good polymerase to do PCR (herculase from stratagene is great,
a Pfu with special buffer in it to increase the fidelity)
3. add 1~3 ul Dpn I directly to the PCR reaction tube. digest it
for at least 3 hours in 37 degree
4.Desalt the PCR sample with PCR purification kit from Qiagen.
5.Transform competent E.Coli.
6. Pick up several colonies , grow small cultures and do miniprep.
7. Send the DNA to sequencing. |
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g****r
发帖数: 14 | 18 I have been using invitrogen 2 step RT kit for a while,
always give me very good result ...
On possible is in your case, your total RNA might
be partially degraded, so that you can only get the
shorter segment, instead of the 1kb product
suggestions:
1) double check your primer design
and PCR condition (TM, Mg conc. pfx? or taq, or pfu?)
2) if everything seems to be correct
be more strict with your RNA extraction
use the ambion RNaseZap to remove environmental factors
(just as much a |
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b******n
发帖数: 4225 | 19 取决多长片段
我用stratagene 的pfu ultra，觉得还不错
至少4k片段不成问题 |
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o******l
发帖数: 284 | 20 LZ,这就是个相对的事.
你想让PFU一次都不出错,那是不可能的. 别说depho,就是限制性内切酶,弄多了,都一
样切开错误的地方.
自连无所谓阿,只要不是绝对优势. |
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s******y
发帖数: 28562 | 21 4kb is not too long ah.
I used to Pfu Turbo (Strategen) for a gene at that length with GC% =65% and
it works fine. I added 0.1% DMSO in the buffer.
Another suggestion is, you can try to amplify two fragments in the same gene
seperately and then ligate them together later. I found it easier for
tricky sequences. |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 没错，是会提高突变率，但那是没有办法的办法（不然高GC的序列扩不出来）
所以必须用pfu turbo |
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n*******g
发帖数: 14 | 23 只替换一个AA . 打算自己用PFU作了。一个小问题： PCR 反应沿PLASMID 走一圈后，
会不会自动地也形成一个圈？还是留下一个NICK？我看KIT没有SEAL NICK 的东西。 |
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e****p
发帖数: 354 | 24 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
)，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢 |
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b******n
发帖数: 4225 | 25 我用PFU做过接近10k的质粒的点突变
取决于引物的设计和高效率的感受态
13k应该也可以吧 |
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b******n
发帖数: 4225 | 26 用gradient PCR去摸退火温度的条件
我经常这么干
另外如果68度扩增不出来，换成72度试试看 |
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s*******r
发帖数: 562 | 29 感觉你的annealing temp太低，引物加上酶切位点怎么也要过60度，一般用60到72度。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 30 我是从commerical plasmid里面克隆cDNA，所以这个引物上面没有酶切位点。。。按照
IDT的Tm计算是50多，但是如果按finnzyme的算就过60了。。。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 31 嗯，它配好的里面Mg终浓度是2mM，但是mannual说要p cDNA的话，最好是用3mM的Mg，
于是我又加了一点，work了一次。。但是再后来我就重复不出来。。。
我的目的片段是2.3kb，我的reaction conditions是：
95度 4min
93度 1min
50度 1min
72度 1min
72度10min
4度 forever
跑30个循环。。。 |
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S*******m
发帖数: 34 | 32 有一个事情没注意到.如果你的cDNA已经在载体上说明已经是双链了.镁离子应该同普通
PCR一样,用
1.5. 3mM是用于扩增作完RT之后的单链cDNA的. |
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n***w
发帖数: 2405 | 33 谢谢。我会试一下。我上面写错了，extension我用的是3分钟。 |
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s***m
发帖数: 6197 | 35 问题解决了没？
你说公司买的vector是什么意思？你给他们序列，他们给你合成的oligo？IDTDNA订的？
你第一次做出来的还保留着没？如果有可以试着gel purified一下，然后用它来做模板 |
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b******n
发帖数: 4225 | 38 我靠，还真有这事情，还以为是在国内呢
咱们一起去开公司吧 |
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s******s
发帖数: 13035 | 39 yes, 如果extension时间足够短的话 |
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s******s
发帖数: 13035 | 40 为啥不直接用phusion，这玩意很好使
impressive |
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x**x
发帖数: 92 | 43 Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
Vector: 5kb
Insert: 4kb
total: 9kb
用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
请大家给些建议， 谢谢。 |
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s*****g
发帖数: 731 | 44 我可以非常不负责任的给你一个数字100。100个copy=1个PFU。
这是一个真的不负责任的数字。
在你实在找不到其他专家问这个问题的时候，你试试这个数字
注：我不是搞HIV的 |
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z********i
发帖数: 610 | 45 MS找到了两个相互作用的蛋白。最初克隆基因的时候发现不容易做出来，不得已用了
Taq酶，测通之后发现有四个点突变（K and E都有)，当时没有太在意，就这样做下去
了，发现有很强的相互作用。克隆的这个基因是kinase，做了KR突变之后,发现KR和WT
的作用一样(reporter assay)，我心里就有点疑惑了,当然kinase-indepdent的效果也
是有可能的。内源的相互作用没有做，在没有拿到confirmed的data之前，估计老板也
不会买抗体。
期间用pfu还是把这个基因克隆出来了，重复了一下原来的实验，发现重复不出来以前的结果，相互作用很弱，可有可无的那种。
难道我以前看到的是假象吗，真有这么点背的吗？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 46 我知道多数做microarray的实验室都自己做Taq，还有偷偷做pfu的.
我们实验室原来做PCR比较多，每个礼拜几百上千的，都去买岂不是饿死 |
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m*********n
发帖数: 215 | 47 你这是啥基因啊？ 有可能是你用的taq／pfu etc.等酶用来selection的基因。我们曾
经需要genotype Lacz，觉得总是污染，但是genotype其他基因都没问题。和楼主一样
所用东西都用新的之后还是不对。后来发现换了一种taq酶之后就好了。我们一致认为
是之前用的那一种taq用lacz筛选过。楼主可以换个公司的酶试试。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 49 Takara的Hotprime的酶很好使，就是突变稍微比pfu高点 |
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