n******m
发帖数: 644 | 1 用的是Pfu，根据模板预测应该是670bp，结果中间有172bp的缺失。 |
|
d***y
发帖数: 8536 | 2 pfu有外切的作用，所以可能把你的引物切了吧，或者条件不对。把Tm 和 Mg 调整一下
。 |
|
S******e
发帖数: 393 | 3 我以前用pfu也碰到过同样的问题, 当时是扩4kb的片断，测了几个克隆，
其中一个克隆中间少了大约五六十个碱基, 很奇怪，也不知道是什么原因 |
|
o*****r
发帖数: 156 | 4 片段这么小，换Taq也应该没问题，而且可以知道是不是pfu的问题了。 |
|
i***l
发帖数: 1656 | 5 普通的 最便宜的 NEB Taq
不用高保真，就看他扩增的长度 跟PFU 的对比一下就知道了 |
|
e****p
发帖数: 354 | 6 Northern 已经看到基因的大小在11kb左右（用RNA LADDER)。
但但转录后 LONGRANGE PCR，扩增中间一段应该是8KB，用PFU扩出来只有最清晰的6KB
左右，重复了一次还是这样，百思不得其解。。。
此外如果CLONE 长练PCR产物，基因中如果有>4KB重复序列如何测序啊，每次只能测个
600-800, 引物设计也是问题。。。
请教各位大侠。 |
|
J********n
发帖数: 534 | 7 much better than pfu series.
DNA |
|
|
m**i
发帖数: 47 | 9 请教大家，我用ddNTP让DNA replication停止了之后，想把ddNTP去掉，然后让DNA继续
复制。我本来想用pfu来做，因为它有3'-5' exonuclease activity,结果发现切不掉那
个ddNTP。大家有没有什么建议呀？多谢多谢。 |
|
c********b
发帖数: 363 | 10 Well, I can share some more of my experience with you.
1, Check out the anneal temperature. If no band here, but your positive
control showed no problem for RT, then I would suspect that PCR failed in
your RACE. You can try touch-down PCR or use 2-step PCR (68 degree for
annealing and extension.
2, Increase your PCR cycles. If the annealing temperature is not perfect,
increasing cycle numbers will help. I normally used 36-40 cycles for 2-step
PCR, in some difficult cases. Also, I tried many diff... 阅读全帖 |
|
s********n
发帖数: 2939 | 11 Statagene好像有一个Pfu是高保真但同时能加A的；Lucigen有GC cloning vector，据
说效率比TA要高不少。 |
|
m*********n
发帖数: 158 | 12 vector 就5kb, insert 0.5kb
用pfu， pcr mutagenesis
dpni消化
然后transformation
挑clone后，我一搬习惯先跑交，发现总有很多clone size around 3kb
我vecotr 5kb也不大呀，这是为什么？
谢谢 |
|
e****p
发帖数: 354 | 13 酶试了几种高保真的 PFU等 还有什么MIX的酶
是对，引物很不好设计。引物也试了几对， 外围的引物弄过一对，有SMEAR 但预期是
是5-6K开始SMEAR, 结果是1K开始SMEAR DOWN, NESTED 就是更短的100，200 BP 的几个
产物。不知道怎么回事？
shuttle pcr 是什么到时没有试过 |
|
d******8
发帖数: 1972 | 14 刚刚拿到了表达质粒的序列结果，发现起始密码ATG 变成了ATC，而且这个起始密码是
引物的一部分，其他所有序列都完全符合。觉得这个测序结果很诡异，基因是用高保真
的PFU扩增的，里面基因无一变异，所以怀疑是引物合成的问题，仔细查看了OPRON的单
子，也没有错。
正好这个起始密码是NCO I 的酶切点，酶切也能线性化，现在我有个疑问，酶切的识别
序列CCATGG（测序是CCATCG)是应该完全符合才能切吧？那测序结果又怎么解释？ |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 16 High fidelity taq is also ok bah |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 18 I think there is someway to add overhang in a high fidelity system |
|
S**x
发帖数: 25 | 19 不好，但是理论上可以用。
the terminal transferase activity isn't 100%
好像从前在哪里看到，70％ pcr product 左右有一端加a
i personally prefer phusion from NEB.
and sometimes I use phusion+taq mixture for difficult PCR reactions. |
|
|
|
A********2
发帖数: 107 | 22 My suggestion is:
1. Test if your recipient strain is phage sensitive
2. Determine how many PFU per ml in your lysate by phage titration assay and
use the appropriate amount of lysate in the transduction. |
|
A******r
发帖数: 121 | 23 首先谢谢大家的时间。因为自己是工程专业，没有生物背景，所以特来问问诸位经验丰
富的大侠们对此的看法。
实验大致上是用喷雾剂喷出一些virus stock suspension，接着用gelatin filter收集
这些带有病毒的小颗粒，然后把gelatin filter溶解在beef extract溶液中，最后用
infectivity assay测病毒的感染性，以及用qPCR测总共病毒的量。
照理qPCR测的是病毒DNA/RNA，而在雾化和空气传播过程中病毒又会失掉一些
infectivity，所以qPCR结果应该要比infectivity assay得到的值（TCID50或PFU）要
高，但是尝试了几种动物病毒和噬菌体之后，qPCR给出的结果都要比infectivity
assay要低（有的甚至低大于一个数量级）。
qPCR的standard curve就是用已知浓度的virus stock系列稀释之后做的。考虑过
gelatin filter和beef extract对viral nucleic acid extraction的影响，也做了几
个小实验验证了一下，发现是有一些影... 阅读全帖 |
|
h******u
发帖数: 131 | 24 pfu 2min/kb 是比较保险的。我扩过13KB的。条件是 26min elongation each cycle.
之前用16min each cycle 做过两次，都失败。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 25 个人觉得pfu是个垃圾酶，高保真没问题，扩增效率太低，速度太慢。
我基本上认为phusion是最好的了，基本上clone都用这个，难办出不来
的换HiFi Taq试试运气，做screen的时候用homemade Taq
. |
|
s******y
发帖数: 28562 | 26 如果你只是想要个平端的话，可以直接用klenow fragment 来把它补齐。
如果根本不想要那个多余的A 的话可以在反应结束后用pfu 处理。
谢！ |
|
y****d
发帖数: 46 | 27 是的，不想要polyA，只是到引物的末端就可以了。
能否详细说说pfu处理的条件？是否需要先把Taq酶除去？
有相关的文献或资料吗？感谢！ |
|
i***l
发帖数: 1656 | 28 frankly, this is kinda common sense
no protocol, but i would do:
clean up your pcr with any available kit, thrown in pfu +buffer; or else,
throw in klenow (NEB) directly into your pcr tube |
|
y****d
发帖数: 46 | 29 感谢大家的帮助和讨论，再多问两句：
1. 加入pfu后的反应温度应该是多少？室温，37度，还是72度比较好？
2. 大概需要反应多长时间？是否有办法确定反应完毕？
对这个领域不太熟，见笑了！ |
|
b******r
发帖数: 111 | 30 I am struggling for testing primers to genotype transgenic mice. I use test
1fg of vector as template mixed with 1ng of genomic DNA,
1. PCR always works when the template contains 1fg of vector but no genomic
DNA.
2.PCR always doesn't work when the template contains both 1fg of vector and
1ng of genomic DNA.
PCR conditions: 25 uL volume, pfu enzyme, 95 for 25",65 for 25",72 for 2'.
product size 1kb
Any solutions to fix this problem? Any PCR enzyme is able to PCR 1 fg of
target gene from genomic... 阅读全帖 |
|
a********k
发帖数: 2273 | 31 同意，platinum hifi算是我用过的最好用的。比pfu，phusion，titanium都好用。 |
|
s****e
发帖数: 5429 | 32 Maybe the titration is not enough. For serum transfer, I would try another
experiment to infect the mice as soon as the transfer is done (just in case
that the serum is diluted and degraded in the body and not provides
protection). For cell transfer, my wild guess is that not enough specific
cells were transferred. I would try to get cells from draining LN for the
experiments (cervical LNs in this case?). Hope this may help.
PFU |
|
c**a
发帖数: 185 | 33 用TurboPfu吗？20k都没问题
94˚C 3min
16cycles : 94˚C 1min
52˚C 1min
68˚C 1min/kb/pfx; 2min/kb/pfu
68˚C 1hr |
|
j****x
发帖数: 1704 | 34 DNA模板中包含dU碱基（由dC deamination而来），一般的高保真聚合酶比如Pfu无法正
常扩增。Taq酶可以扩增但本身错误率较高。
哪位知道何种高保真酶可以完成这种non-canonical base pairing？fidelity越高越好。
多谢！ |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 36 一个最简单的高保真酶的机理就是一个双向酶，既能加一个碱基也能切掉一个碱基。
但是往后退切碱基的活性取决那个碱基对是否是正确的配对，如果是正确的配对，那么
后退切的效率很低，如果是不正确的配对，切的效率就很高。
通过这个简单的机理就能实现高保真。比方说pfu就是这种机理。 |
|
H*******i
发帖数: 196 | 37 1.没有突变有两种可能，一种是dpn1处理不完全，第二（某些设计中）如果你的引物5
’可以匹配一段序列，但是3'是突变，那么似乎高保真酶可以把3’切掉，完成PCR，另
外从smear可以看出，你PCR进行得并不好，如果目标片段之中有什么重复序列相似序列
，出现deletion也是很可能的。 我见到smear最多的就是multimer,如果你引物设计如
果做得和cpec最后一步一样，smear可能性非常高
2.pfu按照NEB说法只有6x的保真性，所以肯定要测序（尤其是引物部分，2.5K用不了10
对引物），克隆做多了 phusion Q5突变都是一堆一堆的。
digestion |
|
e*******e
发帖数: 342 | 38 最近用quick-change的方法构建library，测序后发现在靶向的位点都有突变，但是在
该位点后面都有多出来的引物重复序列。
我所使用的方法及引物的设计是按照Stratagene的QuickChange Site-directed
mutagenesis kit来做的，用的序列完全匹配的一对引物，突变位点在引物的中间。本
来用的是Phusion，后来换成Pfu，结果一样。
不知道有没有这方面的高手，可以分享一下经验。
谢谢！ |
|
b*****s
发帖数: 169 | 39 Pfx50, 是Taq的50x,是我见到最高的。
常用的pfu 是Taq的6x |
|
|
v********a
发帖数: 646 | 41 我需要分析多种组织和细胞里面的RNA-protein interactions, 但是市面上有多种
Protease Inhibitor Cocktail。请问哪种cocktail，适合于RBP的免疫沉淀？
EMD Millipore protease inhibitor cocktail
SIGMAFAST protease inhibitor tablets
BD PharMingen protease inhibitor cocktail
Roche Complete protease inhibitor cocktail
Nacalai Tesque protease inhibitor mixture
Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail
http://www.biocompare.com/pfu/120065/soids/2254598-2254612/Inhi |
|
s******y
发帖数: 28562 | 42 我以前试验过好几种方法，包括我说的那个RNA ligation 的高大上方法，后来发现最
简单最有效的方法就是经典方法：
第一步. 用OligoDT做primer来合成cDNA
我推荐 SuperScript First-Strand Synthesis System
第二步.用基因特异的primer来克隆感兴趣的基因，注意引物要离基因的编码区的
开头(ATG)和结尾(Stop codon)至少有20bp距离（下面我会说原因）。如果基因
的GC含量高，可以用Herculase来做PCR, 不然的话我一般都直接用heat-activated Pfu
turbo.这样非特异带少。
第三步。如果上一步克隆得到的带太多，或者得到一个smear, 那么就再把得到的
产物简单过小柱子纯化后直接用nested primer重新再扩增一次，这样一般都可以
得到一个非常纯的条带。
Nested primer设计的时候必须在上一步用的引物的内侧（这个就是为什么第2步的引物
我告诉你说离开头和结尾有至少20bp距离,就是为了给Nested primer预留地方的）。
primer? |
|
x*****e
发帖数: 309 | 43 赞胖老师耐心，我一般第二步产物跑个胶，直接切下相应大小条带，纯化后用作nested
PCR template.
Pfu |
|
发帖数: 1 | 44 谢谢sunny老师。不过我的是个LINC, 所以估计用不了nested primers.不过我今天订了
那个thermoscript.希望能够成功。
Pfu |
|
|
c*****t
发帖数: 1879 | 46 PCR, then use a blunt-end or TA cloning kit (depending on the DNA
polymerase used) to clone it into a plasmid.
To check, pick a colony, stick it to a PCR tube w/ appropriet mix,
use regular PCR cycle w/ slightly longer 95C at beginning to break
up the cells.
Absolutely no endonuclease involved. If using pfu, at most exonuclease
activity is observed.
hoho |
|
