m*********r
发帖数: 136 | 1 I try to clone a gene by cutting it from one vector to another. However, the
restriction enzyme site will also cut the polyA from vector A, while vector
B already has the SV40 polyA. Is that ok to have two polyA sequence in the
vector?
scheme is like this
MCS+gene+polyA---junk sequence--polyA--
Best, |
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n****3
发帖数: 543 | 2 想利用polyA trap 做基因打靶：long arm-PGK-neo-ires-EGFPFlpe-SD-short arm ，
target 细胞以前整合有Frt-stop-Frt RFP表达盒，平时不表达RFP. 如果转染FLPE表达
质粒，可以切掉stop片段而表达红色萤光。现在想利用polyA trap打靶方法将PGK-neo-
ires-EGFPFlpe－SD片段knockin到目的基因的内含子内. 如果打靶成功，该细胞将可以
表达双荧光，我想尽量减少我筛选打靶事件的工作
转入的片段尽管没有polyA,但启动子和融合蛋白的编码区是完整的，
questions: 那随机整合或瞬时转染会不会也能转录出mRNA(缺少polyA)？如能转录
，这个缺失polyA的mRNA会不会翻译出有功能的EGFPFlpe融合蛋白，并有可能激活红色
荧光蛋白的表达呢？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 3 不同的 polyA sequence长度很不一样，版本也各有千秋
大家自己做construct的时候偏爱用哪个polyA版本呢？
有什么理由么？
Thank you! |
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h******y
发帖数: 351 | 4 这两种polyA在功能上没有什么大的区别。BGH polyA有patent保护，SV40的没有。 |
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i*****i
发帖数: 154 | 5 最近老板要做RNA-Seq看lncRNA的表达。
Illumina的Kit要做PolyA的selection。
但是有人说有些lncRNA是没有polyA尾巴的，所以我问问版上的大侠，大概有多少
lncRNA是没有polyA尾巴的。
是不是用Ribo-zero 处理sample做library更合适一些？
谢谢 |
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m******5
发帖数: 1383 | 6 how is your expression level? mine doesn't express in a proper strength, I
am basically re doing it using exogenous polyA |
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m******5
发帖数: 1383 | 7 我的desired 序列下游有一段FRT序列
是否有任何现成的polyA harboring line可以和我的老鼠mate，再配个flipase
allelle来使得我想要的这个基因表达呢？(想要的这个基因本身不含有polyA) |
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y****d
发帖数: 46 | 8 Taq酶的特征之一是会在PCR之后在3'端加上polyA尾，这方便了作TA克隆，但是我现在
的实验不希望有这个polyA尾，是否什么办法把它去掉，变成和pfu类似的平末端？谢谢！
补充：实验必须用Taq酶，不能换成pfu或Phusion之类的酶。 |
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j*p
发帖数: 411 | 9 大部分(>90%)lncRNA有polyA. Ribo-zero 数据远不如polyA selected数据来得平滑.
just a trade off, up 2 you |
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y*********u
发帖数: 183 | 10 that is also how I figured it, I designed such a knock in animal by
replacing the whole exon1 and exon2 (keep some flanking sequence as splicing
context) without additional polyA signal. I am hoping it would work
binding |
|
m******5
发帖数: 1383 | 11 5'
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC
CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG
GTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG 3'
I am currently designing a transgenic vector, I cloned this BGH polyA signal
from PCDNA 3.0
could anyone here familiar with it help me to check if this poly A signal is
complete enough? |
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y****d
发帖数: 46 | 12 是的，不想要polyA，只是到引物的末端就可以了。
能否详细说说pfu处理的条件？是否需要先把Taq酶除去？
有相关的文献或资料吗？感谢！ |
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r*****8
发帖数: 2697 | 14 MALAT1应该有polyA tail, 否则TruSeq应该无法检测到 |
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b******y
发帖数: 627 | 15 Work from Phil Sharp lab showed that MALAT1 is not polyAdenylated. As
pointed out by polycomb, it has a triple helix. One or two strands of the
triple helix is polyA like, which is encoded in the gene. |
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C**S
发帖数: 522 | 16 我有一次装载体的时候polyA没加上，就导致表达很低。 |
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m******u
发帖数: 12400 | 18 能确认这是pre-mRNA，而不是alternative splicing产物？若是后者，这应该算是成熟
的mRNA。
严格意义上pre-mRNA是没有poly（A）的，更严格意义上说，是没有pre-mRNA这个东西
的，因为转录过程中，帽子已经加上了，前边的intron已经间接了。
（当然，因为细胞内的所有的代谢过程是会出错的，很短很小的转录本（含一或两个内
含子的）肯定会有没被剪接的内含子，在外在变现就是有poly（A）tail的 pre-mRNA）。
发信人: shakuras (doskey), 信区: Biology
标 题: Re: premRNA也有polyA tail么？
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Feb 25 10:47:25 2014, 美东)
有啊。有时候会克隆出来 |
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s******s
发帖数: 13035 | 19 你搞啥捏。没出核的就是pre-mRNA啊。
细胞里面基本是先polyA再剪切的，polyT调出来的RNA
很多有intron, 当然取决于抽提方法，尽量保留核结构
大多数就出不来了
）。 |
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z*********s
发帖数: 38 | 20 最近用pCDNA 3.1+质粒表达蛋白，请问质粒是在哪个位置被切开加上polyA尾巴的，具
体是怎么样一个过程？ |
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z*********s
发帖数: 38 | 21 我的问题可能没有问清楚，我想问的是对于pCDNA3.1质粒，polyA是加在质粒对应的哪
个位置的？ |
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n**u
发帖数: 87 | 22 This is polyA you are asking.....
：从manual里面copy过来的：
：Bovine growth hormone (BGH) polyadenylation signal |
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l******s
发帖数: 82 | 23 Hilbert在1917年春天访问时Zurich时，安排了一次面试，
Hurwitz的数学圈子里的Polya和Bernays，paul同Hilbert
一起散步，Hilbert考查的重点是数理逻辑，最终拿到通往
Gottingen门票的是更为沉默寡言的Bernays，显然Hilbert
对Bernays的气质更为欣赏一些
有关Polya的另一个传说是有一年圣诞节Polya坐火车从Zur-
ich到Frankfurk，车上Polya把一个男孩的篮子碰掉了，他
们俩吵起来，结果男孩带有一种强烈优越感的高傲把Polya激
怒了，他上去就是一个耳光...,后来Polya才知道，男孩的
父亲就是Gottingen的头面人物 |
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e*******n
发帖数: 4912 | 24 101. 1917年，日本数学家挂谷宗一（Kakeya，S(1886-1947)）提出
一个问题：一位武士上厕所时遭到袭击，他只有一根短棒，为了
挡住射击，短棒应旋转360度（支点可以变化），但厕所很小，
问短棒最少要扫过多大面积？
这个问题引起当时很多人的兴趣，如1925年Birkhoff在他
写的The origin, nature, and influence of relativity
一书中提到“近几年日本数学家挂谷宗一提出的问题，是同样令
人感兴趣的问题”
1928年，苏联数学家Besicovitch，Abram Samoilovitch
（1891-1970）解决了这个问题，答案是可以任意小，1960s
Besicovitch在美国数学会就挂谷问题专门做了期科普电影，
有意思的是中间他打了个喷嚏，Besicovitch觉得很不雅，
坚持要求在录像中把这个镜头剪掉，于是现在人们看到的是
镜头突然转向一边，然后是一声闷响....
102. William James seemed to have what seemed vitally important
ideas in d... 阅读全帖 |
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c******r
发帖数: 3778 | 25 这个很简单，仔细想想就明白了。
当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的，所以对各个RNA
的RT efficiency是不一样的，所以以后的qPCR都没意义了。
如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是
polyA会RT，而你的specific primers也可以RT，结果是你的target被polyA和specific
primers分别RT，而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency
是不一样的，所以二者不再可比。
所以只能要么用poly A，要么target和control都用specific primers。
btw，gapdh的做RT是有kit的，买一个就可以了吧？
QC； |
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发帖数: 1 | 26 CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC
CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG
GTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
bGH PolyA signal
mammalian terminators (SV40, hGH, BGH, and rbGlob) include the sequence
motif AAUAAA which promotes both polyadenylation and termination. Out of
those listed, the SV40 late polyA and rbGlob polyA are thought to be more
efficient in terminating transcripti... 阅读全帖 |
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y*********u
发帖数: 183 | 27 Anyone here have experience how to add polyA signal when making knock in
allelle?
someone said that we should not add any polyA signal at all by which they
assume that they are using the orginal polyA signal of the knock in allelle |
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j****x
发帖数: 1704 | 28 其实分子生物学的反例太多，所谓规律很大程度上只是基于统计
举个例子，起始ATG有所谓Kozak consensus，但是这也只是大约70%的真核mRNA所“遵
循”的一个规律，仍大量的mRNA不符合这个规则一样可以翻译，甚至翻译的很好。
polyA processing这里是同样的问题，比如AATAAA并不绝对，TATAAA已经其他一些变体
也非常普遍，甚至没有这个polyA signal在下游其他一些motif的帮助下也一样可以完
成。GU rich region就更模糊了，要多少个repeats才算rich，怎么算？从哪里开始算
？这些都并不非常清楚，只能说，基于统计存在这个规律，同时在一些研究的比较透彻
的polyA signal序列中找到了一定的实验证据。至于是不是伪命题，你应该有你自己的
判断。 |
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y*********u
发帖数: 183 | 29 如图
我要knock in表达的原基因有4个exon，我想插入一个EGFP reporter
，于是把exon1和exon2 replace掉（留下一小部分flanking sequence）
因为这个基因的3'UTR的调控做得很热，因此我就不能引入外源polyA 比如SV40, BGH
polyA等
粗看过去似乎问题不大，我用的EGFP的编码做过修改不含有splicing context
但是也有人说不加外源polyA的knock in表达很靠运气？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 30 在一个endogenous site
想knock-in一个 GeneA-IRES-GeneB-polyA
理想状况下Gene A和GeneB会在一个大mRNA上分别translate出来
现在面临的问题是，理论上说，核内有一套和核外不同的non sense mediated decay机
制，负责降解stop code和polyA离得太远的情况。 在我的case里GeneA的stop code和
polyA是很远的，因为中间隔了一个IRES，
问问有经验的同学，这种情况下geneA有危险么？ |
|
B***v
发帖数: 113 | 31 我现在想我可能不需要minicircle DNA, 我只需要把我的construct (promoter-insert
-polyA)两端加上黏性末端连成circle DNA就行了。我给这个公司打电话了，
minicircle DNA backbone有1.2 kb, 如果我直接连起来连这个1.2 kb都没有，更小。
就是不知道这两种format哪个表达更好
linear promoter-insert-polyA vs. circular promoter-insert-polyA |
|
发帖数: 1 | 32 GFP/RFP在两个同源臂的中间，自带promoter，不需要在exon上，为了移除荧光标签，
标签的两边连LOXP或者PiggyBac的TTAA-ITR。
左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂-promoter-BFP-polyA-
donor backbone
通过同源重组之后，左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂 会
进入基因组，如果donor存在randon integration，那么BFP也会表达，筛选BFP
negative/GFP positive/RFP positive的细胞即可。
然后过表达piggyBac transposase之后，筛选标签移除，变成左同源臂-ttaa-右同
源臂，
突变成功。
在设计左同源臂和右同源臂的时候，选择带有ttaa的位点分界，ttaa不要包括在同源臂
内。
说到这里，你是不是应该去补习一下基础理论知识。 |
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f*******e
发帖数: 354 | 33 这样的话转录应该就终止了吧。但是如果这个intron后面已经没有编码的exon，那就相
当于替换了基因自己的utr而已，并不一定改变表达水平。
:
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC
:
CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG
:
GTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
: bGH PolyA signal
: mammalian terminators (SV40, hGH, BGH, and rbGlob) include the
sequence
: motif AAUAAA which promotes both polyadenylation and termination. Out
of
<... 阅读全帖 |
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m********6
发帖数: 1283 | 34 人均定理发现率
最重要的100个数学定理,中国人发现了几个? 1个?
1 根号2的无理性
毕达哥拉斯 和他的学派 公元前500年
2 代数基本定理
卡尔•弗里德里希•高斯（Karl Frederich Gauss）
1799
3 实数集的不可数
康托（Georg Cantor）
1867
4 勾股定理
毕达哥拉斯 和他的学派
公元前500 年
5 素数定理
阿达玛（Jacques Hadamard） 和普森Charles-Jean de la Vallee Poussin(分别地)
1896
6 哥德尔不完全性定理
哥德尔（Kurt Godel）
1931
7 二次互反律
高斯（Karl Frederich Gauss）
1801
8 三分角 与倍立方体的不可能
旺策尔（Pierre Wantzel）
1837
9 圆的面积
阿基米得（Archimedes）
公元前225
10 费马小定理的欧拉推广(Fermat’s Little Theorem)
欧拉（Leonhard Euler）
... 阅读全帖 |
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x********e
发帖数: 35261 | 36 中国的基因组库目前有138个毒株信息，依然符合我目前的分析。我个人建议，把Wuhan
-Hu-1/2019作为root，下面分两支，一支H1（NS1序列缺失15nt，polyA缺失），一支H3
（N-ter 缺失15nt+2点突变，polyA缺失） |
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x********e
发帖数: 35261 | 37 当然不。在生物学和病毒学上，polyA的长度影响病毒蛋白的表达，越长越好。病毒的
polyA应该跟telomere一样，越来越短。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 38 知道为啥叫S和L亚型吗？short和long的首字母。其中长的部分很可能是C端的polyA
tail。已经有研究表明PolyA调控病毒蛋白翻译，tail越长，蛋白翻译效率越高。另外
一个区别在于N端，S亚型和蝙蝠病毒类似，要比L亚型短十几个核酸。这多出来的核酸
很可能影响mRNA capping，影响Orf1ab的翻译。Orf1ab编译了病毒调控宿主免疫的蛋白
和自身复制的蛋白。Orf1ab翻译效率越高，毒性就越强。 |
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m********6
发帖数: 1283 | 39 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: majia12346 (我们灌水好辛苦), 信区: Military
标 题: 人均定理发现率..最重要的100个数学定理,中国人发现了几个? 1个?
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Aug 28 05:24:13 2012, 美东)
人均定理发现率
最重要的100个数学定理,中国人发现了几个? 1个?
1 根号2的无理性
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2 代数基本定理
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6 哥德尔不完全性定理
哥德尔（Kurt Godel）
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高斯（Karl Frederich Gau... 阅读全帖 |
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a*****g
发帖数: 19398 | 40 我一直说 common core 出的问题，现在终于有其他人出文章了
http://www.theatlantic.com/education/archive/2015/11/math-showi
Common Core-era rules that force kids to diagram their thought processes can
make the equations a lot more confusing than they need to be.
Rogelio V. Solis / AP
At a middle school in California, the state testing in math was underway via
the Smarter Balanced Assessment Consortium (SBAC) exam. A girl pointed to
the problem on the computer screen and asked “What do I do?” The proctor
read the instruc... 阅读全帖 |
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m********6
发帖数: 1283 | 41 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: majia12346 (我们灌水好辛苦), 信区: Military
标 题: 人均定理发现率..最重要的100个数学定理,中国人发现了几个? 1个?
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Aug 28 05:24:13 2012, 美东)
人均定理发现率
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1 根号2的无理性
毕达哥拉斯 和他的学派 公元前500年
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3 实数集的不可数
康托（Georg Cantor）
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公元前500 年
5 素数定理
阿达玛（Jacques Hadamard） 和普森Charles-Jean de la Vallee Poussin(分别地)
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6 哥德尔不完全性定理
哥德尔（Kurt Godel）
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7 二次互反律
高斯（Karl Frederich Gau... 阅读全帖 |
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f*****y
发帖数: 464 | 42 RNA probe.用brain tissue做试验。做northern blot背景很强，rRNA的位置crosshyb
很多（total RNA和polyA RNA都是），真正的条带相对很微弱。可是奇怪的用这个
probe做的FISH的结果很干净，信号看着一点不像backgroud. target出现在部分neuron
里，non-neuron里完全没有。
想请教试验大牛们，这FISH结果能相信吗？
如果FISH能crosshyb到rRNA上，看上去啥样？
怎样能改善northern的结果呢？polyA RNA仍然不能完全清除rRNA,所以还是有crosshyb
.
多谢。 |
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V**F
发帖数: 164 | 43 不做这个很多年，有点糊涂了
想在已有的vector 加一个ampicillin resistance gene （AmpR)，除了加 promoter (
-10 和-35), AmpR的coding sequence外，还要加terminator sequence 或者polyA
signal吗？AmpR 只需要在E.coli里面表达就行了,参照了很多vector,都没有指明有没
有terminator或者polyA signal. |
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b*****o
发帖数: 150 | 44 You don't have to add polyA to your cDNA
The knockin construct normally has its own promoter and polyA region.The expression cassette will be randomly inserted into (any) genomic DNA.
What's your mean "allele"?
When use "allele" it normally means "the genomic region of the gene", you can delete, mutate or add (tags etc) to any part of your allele in vitro, then knock it in.
allelle |
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m******5
发帖数: 1383 | 45 非常感谢你的提示
根据你的提示读了很多文章，得知GU rich sequence确实对于其process必不可少
但是又有一个很大的疑问：很多内源的polyA signal并不含有GU rich sequence，只有
AATAAA这个conserved motif，下游是一堆随机碱基，请问这种情况下polyA加尾是如何
实现的呢？
这是一个有共识的问题么？或者只是一个伪命题？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 46 急求，急求……急急急急…………
在网上扫了半天没头绪 |
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H****N
发帖数: 997 | 47 I made one myself, but have not published it yet. |
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m******5
发帖数: 1383 | 48 really? how do you design it? is it a mice or other animal model?
I also made one but I am worrying about it |
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H****N
发帖数: 997 | 49 I just replaced the endogenous orf with my orf. |
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f******9
发帖数: 22 | 50 Does anyone know if there is any different between human growth hormone
polyA and bovine growth hormone polyA? why some expression cassette use
human other use bovine? Any specific purpose?
Plus bovine is much short than human ones, make me wonder why we do not use
bovine poly instead.
Anyone knows? Thanks. |
|
