X***n
发帖数: 366 | 1 polyA polymerase
MMLV RTase
SYBR qPCR master mix
It's not complicate. Why do you need kit?
kit |
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i**y
发帖数: 71 | 2 Some working definitions of lincRNA include polyadenylation |
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p******b
发帖数: 379 | 3 MALAT1好像就没有尾巴， 3‘有个triple helix 结构， |
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r*****8
发帖数: 2697 | 4 有道理, 刚刚看了下Sharp的paper, 对照了RNAseq data, 比较吻合 |
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K*C
发帖数: 2825 | 5 那主要应当是polyA问题吧，wt和mutant的poly A 应当没什么区别吧
ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcc |
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l***y
发帖数: 4671 | 6 听说过 histone mRNA 靠 stem-loop 而不是 poly-A tail。
neo- |
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C**S
发帖数: 522 | 7 能转录和翻译。只不过mRNA半衰期会很短，蛋白表达的水平会很低。 |
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n****3
发帖数: 543 | 10 是mRNA还是蛋白水平。我就是希望蛋白水平低到不足以切割 |
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C**S
发帖数: 522 | 11 蛋白
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8 |
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c********b
发帖数: 363 | 15 wrong (or at least inaccurate) answer |
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i*********0
发帖数: 915 | 17 谢谢啦！如果我看到一个gene intron表达是在control 和mutant里面比较一致，但是
检测exon的水平有差异的话，是不是表明，这个gene的转录后调控出了问题？ |
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s******r
发帖数: 1245 | 18 你能肯定不是genomic dna contamination？ |
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i*********0
发帖数: 915 | 19 做cDNA synthesis之前做了DNAse 1的处理。在去qPCR的时候，我同时做了这个gene的
exon，3‘UTR 和2个introns的PCR，exon和3’UTR 有3倍的表达差异，两个intron都没
有差异。 |
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s******r
发帖数: 1245 | 20 dnase处理不一定是完全的，需要做no RT control来排除 |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 PolyA 以及ribosome binding site我们可以自己加啊。
我比较担心的是RNA pol III 是不是不能转录比较长的RNA? 或者转录出来的头部结构
不对所以核糖体结合不上去？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 25 首先你需要5'的mG cap，这个是核糖体结合的识别信号对吧？U6/H1都没戏。当然你可
以搞个IRES，但是效率是个问题。polyA自己加？这个不现实吧，合并IRES，基本上就
超过POL III的理想转录本长度范围了，何必冒险呢，既然要做表达载体，这么折腾没
任何意义啊，你要的这类载体满天飞，不行几百块买一个或者直接序列合成了 |
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g*r
发帖数: 67 | 26 未知是指物种没有已知的基因组参照? 还是指没有类似的实验结果?
如果经费不是问题，当然可以制两种library。
对已知物种一般没必要normalization。基因表达量太低，生物学意义也不明了。
对未知物种，当ribosomal depletion 或polyA seletion 成功，并且sequencing
depth足够高，绝大部分有表达的基因都能测到。
normalization可以降低高表达基因的读数，但我也不确定会不会提高低表达基因的读
数。你可以先拿public data做research看变化有多大。无责任推测不会有太大帮助，
因为被测出来的基因都起码有一定的表达量。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 27 你这一问，也让我糊涂了。：）。
当年作knockout老鼠的construct的时候都是用pUC18-19，最后是linearized后
electroporation。你这一问，我去查了一下我准备用的vector,是一个mammalian
expression vector,后面有个0.6Kb 的polyA signal，好像是从人的基因来的，这不是
增加了和那个位点的homologous recombination机会么。
咱俩一起问：谁有经验和建议？谢谢！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 28 个人经验stop至少是一个完整的polyA signal. 但一个精彩漏 |
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y**u
发帖数: 69 | 29 想把3'UTR克隆到reporter gene后面，还需要加额外polyA signal吗？我觉得似乎没必
要因为3'UTR里面应该自带了吧，但是看到有些人3'UTR后面还跟了比如SV40 pAS，请问
有必要么？
再一个问题是，想克隆完整的3'UTR，但是发现比较难，特别是3'端的序列，一般很多
重复序列，不好设计引物，请问怎么解决这个问题？
谢谢 |
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a****l
发帖数: 8 | 30 准备用crispr技术在小鼠knock in人的基因。请教大牛：donor vector里人的基因仅有
cDNA序列可以吗？需要加polyA signal吗？需要加3’UTR吗？多谢！ |
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S******y
发帖数: 2 | 31 as i can recollect, pcdna was generated by synthesis. |
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S******y
发帖数: 2 | 32 after every eukaryotic gene cds. So in this case, after mcs and neomycin. |
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T*****e
发帖数: 247 | 33 从manual里面copy过来的：
Bovine growth hormone (BGH) polyadenylation signal
Efficient transcription termination and polyadenylation of mRNA (Goodwin and
Rottman, 1992)
这应该是3'UTR吧，正常就是3'UTR后面
肯定在neomycin和它的SV40启动子前面，也跟f1 ori没啥关系
所以就在bgh signal的后面 |
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j******i
发帖数: 939 | 34 如果你的目的蛋白有polyA且没有反方向放的话 在293T细胞里会得到大量的不完整的
viral RNA 这种不完整的RNA即使能包装到病毒也是不能逆转录产生viral DNA的
stable |
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j******i
发帖数: 939 | 35 Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9， 然后
把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。 |
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g*****n
发帖数: 241 | 36 线虫里有没有non polyadenylated mRNA呢？
其他生物的histone的mRNA是没有的，但线虫的histone貌似也有polyA
谢谢 |
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c**i
发帖数: 265 | 37 没有polyA, ribosome不能被recruit，无法翻译
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 11 |
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B***v
发帖数: 113 | 38 你这个有点意思，我头一次听说，3kb确实很小，比我现在加个polyA之后1.9kb也大不
了台多。我研究一下。Minicircle DNA应该稳定性更好？转录效率更高？ |
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l***s
发帖数: 841 | 39 lncRNA当作mRNA polII就行了。也有polyA。 至于miRNA，用polIII的termination
signal.目前的vector都设计好了，直接用就行。 |
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d******t
发帖数: 27 | 40 韩自己回复搬运如下，他自己也承认图四有难度：槐北路 1
12楼今天 16:22
操作
我目前仍只有一个做实验的小团队，无法做好服务性工作，一天十几个个电话我都是重
复的以下内容：----所谓
高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染（
Ago系统对污染特别敏
感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响
GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我
就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明
质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差），guide磷酸化完全（没
有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看
看---），特别的，对于Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密
度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照着
online method上protocol for genome editing and T7E1做（小经验... 阅读全帖 |
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d******t
发帖数: 27 | 41 http://www.zhihu.com/question/46 ... mp;isappinstalled=0
韩自己回复搬运如下，他自己也承认图四有难度：槐北路 1
12楼今天 16:22
操作
我目前仍只有一个做实验的小团队，无法做好服务性工作，一天十几个个电话我都是重
复的以下内容：----所谓
高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染（
Ago系统对污染特别敏
感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响
GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我
就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明
质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差），guide磷酸化完全（没
有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看
看---），特别的，对于Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密
度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照... 阅读全帖 |
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m****a
发帖数: 270 | 42 是谁吃完饭没事干去跟方舟子告状？？
http://fangzhouzi.baijia.baidu.com/article/523403
不久前河北科技大学韩春雨在《自然·生物技术》发表论文报告了一种基因编辑新方法
NgAgo，在国内轰动一时。被《知识分子》作为末流学校土博士也能做世界一流科研的
典型，国内其他媒体随后跟进宣传，甚至称之为“诺贝尔奖级”的研究成果。
这几天我陆续收到几家实验室的研究人员的来信，反映重复不出韩春雨论文中最关键的
图4结果（切割基因组，T7E1和测序），呼吁我关注一下这事。
有些人已在网上生物专业论坛公开讨论此事，报告他们没法重复该实验，询问有谁重复
出来了。目前还未见有人反映重复出了图4结果。有的能够重复论文中的图3结果（FACS
和Western Blot），但那有可能是假阳性。
据听报告的人说，韩春雨在北大和遗传所的报告上都强调，他目前的NgAgo是初级版、
需要高超的实验技巧、等他推出2.0版和Smart版。这些说法跟他在论文里的描述是矛盾
的。因为他描述的只是个并不复杂的转染实验，T7E1和测序也都是现成的技术，并不需
要高超的实验技巧，按照其提供的... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 43 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Dr Joseph Miano
- 发布时间：2016年9月27日
- 发布平台：google groups
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Rochester NY
- 发布方研究机构：U Rochester
- 实验室PI：Dr Joseph Miano
- NgAgo的来源：original NgAgo sequence or codon optimized NgAgo, with
elements designed for expression in mouse
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果， 实验室在
Addgene proto... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 44 第四类“重复” 验证实验信息：实名, 网络、论坛发布
- 重复、拓展验证实验不能支持NgAgo基因组编辑功能
- 包含有具体实验信息（eg实验材料，步骤，etc）以及发布方具体信
息的发布报告
- 需包含发布时间
- 建议注明是否应用2016年8月8日韩春雨组在Addgene更新的Protocol的相关条件
信息简述：
- 发布方：Dr Joseph Miano
- 发布时间：2016年9月27日
- 发布平台：google groups
- 发布方国家：美国
- 发布方城市：Rochester NY
- 发布方研究机构：U Rochester
- 实验室PI：Dr Joseph Miano
- NgAgo的来源：original NgAgo sequence or codon optimized NgAgo, with
elements designed for expression in mouse
- 应用验证实验结果: 无法验证韩春雨NgAgo基因编辑的实验结果， 实验室在
Addgene proto... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 45 想在CMV驱动的GFP的3‘UTR插入一个U6驱动的RNA片段。
目的是在细胞里得到两个transcripts，一个是GFP-3'UTR-U6-RNA-polyA，一个是这个
RNA，方便进一步的其它实验。
直接这样做克隆能表达吗？
求大神指点，谢谢！ |
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K****n
发帖数: 4 | 46 各位大牛，如果我想表达pri-miRNA with GFP, 我可以直接在GFP下游连接pri－miRNA
sequence吗？这样会影响下游的polyA seq吗？可以共享一个promotor （CMV）吗？还
是最好用两个promotor？需要用U6 drive pri-miRNA吗？不知道U6和CMV比，哪个更适
合？ |
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r**a
发帖数: 121 | 47 不是专家啊，但是好像tRNA转录结束有专门的序列，应该不是polyA |
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l*********d
发帖数: 315 | 48 tRNA莫有polyA，会不会是从Adapter上带下来的？ |
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s******r
发帖数: 1245 | 50 5'cap没了和没polyA理论上都不能initialize translation |
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