m****a
发帖数: 270 | 1 是谁吃完饭没事干去跟方舟子告状？？
http://fangzhouzi.baijia.baidu.com/article/523403
不久前河北科技大学韩春雨在《自然·生物技术》发表论文报告了一种基因编辑新方法
NgAgo，在国内轰动一时。被《知识分子》作为末流学校土博士也能做世界一流科研的
典型，国内其他媒体随后跟进宣传，甚至称之为“诺贝尔奖级”的研究成果。
这几天我陆续收到几家实验室的研究人员的来信，反映重复不出韩春雨论文中最关键的
图4结果（切割基因组，T7E1和测序），呼吁我关注一下这事。
有些人已在网上生物专业论坛公开讨论此事，报告他们没法重复该实验，询问有谁重复
出来了。目前还未见有人反映重复出了图4结果。有的能够重复论文中的图3结果（FACS
和Western Blot），但那有可能是假阳性。
据听报告的人说，韩春雨在北大和遗传所的报告上都强调，他目前的NgAgo是初级版、
需要高超的实验技巧、等他推出2.0版和Smart版。这些说法跟他在论文里的描述是矛盾
的。因为他描述的只是个并不复杂的转染实验，T7E1和测序也都是现成的技术，并不需
要高超的实验技巧，按照其提供的步骤应该是不难被重复出来的。
韩春雨获悉有人重复不出其实验结果后，不是解答疑惑，而是谩骂这些人是“跳梁小丑
”、是搞别的基因编辑技术（CRISPR）的人的抹黑，威胁要对他们进行人肉搜索。
我当然不怕被人肉，也不怕挨骂，所以在此问几个问题：
第一，有没有人重复出了韩春雨论文中的图4结果？有的话跟我说一下。
第二，据称韩春雨在遗传所的报告上说，重复出来和不能重复的比例是1:3，能重复出
来的有20家。那么究竟有哪家实验室重复出来了？（指图4结果）这事没必要保密吧。
第三，韩春雨说做这个实验“需要高超的实验技巧”，那么究竟在哪个步骤需要什么样
的高超实验技巧？
为什么一个新实验的结果别人都反映重复不出来，原因很多，比如可能是重复出来的都
不吭声，重复不出来的实验技术不行，论文中隐瞒了关键的“实验技巧”（这不道德）
，或者论文报告的结果干脆就是编的（这更不道德）。一个新的科学发现、技术，需要
经过别人的重复才得到公认。别人重复不出来，有疑问，是很正常的。作为首创者应该
做的是去消除疑问，而不是攻击、谩骂，否则那更让人怀疑。
2016.6.30。
----------------------------------------------------------------------------
--------------------------
以下是韩春雨在百度贴吧里的回复，总结一句话就是如果做不出来很可能是你细胞出问
题了，最有可能就是NgAgo被支原体给吃了。。。（注：本人对韩老师没有偏见，希望
有确切阳性结果的实验室能早点给出报告，毕竟多一种好用的工具对大家都有好处。）
http://tieba.baidu.com/p/4645810480?pid=93027569268&cid=0&from=prin#93027569268
我目前仍只有一个做实验的小团队，无法做好服务性工作，一天十几个个电话我都是重
复的以下内容：
----所谓高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原
体污染
（Ago系统对污染特别敏感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下
，单转guid不会影响
GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我
就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明
质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差），guide磷酸化完全（没
有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看
看---），特别的，对于Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密
度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照着
online method上protocol for genome editing and T7E1做（小经验，PCR最好不要有
引物二聚体，如果引物二聚体多请重设引物；PCR产物直接回收最好不跑胶回收，可能
跟ago切24bp有关，设好对照！）---银染分辨率高，可以排除T7E1假阳性，能做出预期
条带后请用PCR产物去测序--------欢迎大家广泛使用此系统，并分享成功经验和失败
教训。附，addgen上的质粒，可
以直接用作基因组编辑。再次强调，不加NgAgo，就能抑制GFP，是假阳性，是细胞出问
题了（谢天谢地不但
我自己而且审稿人也有这个对照）出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4，若
是不习惯做银染，也可
以直接做KI：doner 用GFPcoden+polyA signal，前后加几个保护性的碱基---从GFP-N1
扩出来连到T-vector上，再从此doner-Tvector上扩（防止GFP-N1污染的假阳性）出来
纯化，500-800ng共转（for each well of 24 well plate）。 |
j*********g
发帖数: 463 | 2 原来高超的实验技巧就是要避免细胞被支原体污染呀。长见识了。
韩春雨每天转进一次：
开始是重复出来的都低调，不站出来；
后来又受了mitbbs的启发，说是磷酸化要自己做，不能公司合成。（公司合成的效率还
不如自己用T4PNK催化？他文章也压根没提，就是顺着别人说。）
现在又是别人的细胞污染了。
这样的理由他还可以继续找下去，比如石家庄雾霾比较严重，国外实验室没有雾霾，雾
霾促进NgAgo活性。真是胡闹够了。当初小保方面对质疑，也是不断用各种细节搪塞的
吧。
记住：他文章里面测试了50个位点切割基因组，每个都work，效率至少20%。这样的效
率要银染才能看到？还有，银染又是什么高超的实验技巧？照着protocol配好buffer，
把胶扔进去，高中生都会做。 |
t****w
发帖数: 130 | |
l*****7
发帖数: 8463 | 4 《高超的实验技巧》肯定是不恰当用语。
正确的用语应该是 《需要有那么一点点小决窍和细节》。
学术界为了竟争，赶论文，文章中故意或无意省略了实验／研究技术的小决窍和细节是
很常见
的, 与道德不道德无关。 |
s*********y
发帖数: 292 | 5 我感觉，这东西不太可能重复出来了
说来说去，就是个转染，效率高也好，低也好，是真的总能做出来，像CRISPR一样 |
l*****7
发帖数: 8463 | 6 你有信心只说两个字 “造假” 吗？
【在 s*********y 的大作中提到】
: 我感觉，这东西不太可能重复出来了
: 说来说去，就是个转染，效率高也好，低也好，是真的总能做出来，像CRISPR一样
|
b***g
发帖数: 110 | 7 现在国内有些人直接去韩春雨实验室做实验验证了，据内线报道丹麦阿伦实验室，还有
二院黄主任实验室都重复出了结果，只是目前的效率确实没有优化的cas9高。
【在 l*****7 的大作中提到】
: 你有信心只说两个字 “造假” 吗？
|
C***3
发帖数: 29 | 8 发个nature protocol吧。又可以刷文章，又可以清楚告知大家各种细节。 |
d********m
发帖数: 3662 | 9 丹麦那位能给个全名吗？
【在 b***g 的大作中提到】
: 现在国内有些人直接去韩春雨实验室做实验验证了，据内线报道丹麦阿伦实验室，还有
: 二院黄主任实验室都重复出了结果，只是目前的效率确实没有优化的cas9高。
|
C****5
发帖数: 32 | |
|
|
C****5
发帖数: 32 | 11 去韩的实验室做实验，是不是要把质粒带回来测个序！ |
t******k
发帖数: 599 | 12 没有任何经验，很不厚道的脑补一下，有没有可能是韩的细胞污染了，然后神奇的fig4
就出来了。之后别人的细胞没有污染反倒出不来了。就像化身博士里的情节一下，最后
发现是因为第一次的某种未知污染造成了实验成功。。。。 |
S**********e
发帖数: 620 | 13 可是他解释的技巧并不高超，只是基本功而已。
【在 l*****7 的大作中提到】
: 《高超的实验技巧》肯定是不恰当用语。
: 正确的用语应该是 《需要有那么一点点小决窍和细节》。
: 学术界为了竟争，赶论文，文章中故意或无意省略了实验／研究技术的小决窍和细节是
: 很常见
: 的, 与道德不道德无关。
|
S**********e
发帖数: 620 | 14 有同感，很多条件work的范围都没有那么严格的，只要不是限速步骤，经常差别几倍都
可以做出来，是不是最佳条件另说。
【在 s*********y 的大作中提到】
: 我感觉，这东西不太可能重复出来了
: 说来说去，就是个转染，效率高也好，低也好，是真的总能做出来，像CRISPR一样
|
c**i
发帖数: 265 | 15 我相信这个实验是可以重复的，但这些所谓的技巧也太初级了吧。用的是HEK 293又不
是什么特殊的cell line， 现在的PCR酶和buffer根本不用考虑二聚体的问题。
“所谓高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原
体污染” “对于Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密度和用
血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化” "小经验，PCR最
好不要有引物二聚体，如果引物二聚体多请重设引物“ |
w******n
发帖数: 767 | 16 韩把大家当白痴了。
FACS
【在 m****a 的大作中提到】
: 是谁吃完饭没事干去跟方舟子告状？？
: http://fangzhouzi.baijia.baidu.com/article/523403
: 不久前河北科技大学韩春雨在《自然·生物技术》发表论文报告了一种基因编辑新方法
: NgAgo，在国内轰动一时。被《知识分子》作为末流学校土博士也能做世界一流科研的
: 典型，国内其他媒体随后跟进宣传，甚至称之为“诺贝尔奖级”的研究成果。
: 这几天我陆续收到几家实验室的研究人员的来信，反映重复不出韩春雨论文中最关键的
: 图4结果（切割基因组，T7E1和测序），呼吁我关注一下这事。
: 有些人已在网上生物专业论坛公开讨论此事，报告他们没法重复该实验，询问有谁重复
: 出来了。目前还未见有人反映重复出了图4结果。有的能够重复论文中的图3结果（FACS
: 和Western Blot），但那有可能是假阳性。
|
r*******e
发帖数: 680 | 17 难道这是又要丢人现眼了吗？
【在 w******n 的大作中提到】
: 韩把大家当白痴了。
:
: FACS
|
c**i
发帖数: 265 | 18 We thank W. Chao for performing flow cytometry experiment. This work was
supported by the National Science Foundation of China 31270950 to X.Z.S.
Correspondence should be addressed to C.H. ([email protected]/* */).
原来用的funding都不是韩自己的钱，不容易啊。邮箱还是阿里云的。 |
c**i
发帖数: 265 | 19 We thank W. Chao for performing flow cytometry experiment. This work was
supported by the National Science Foundation of China 31270950 to X.Z.S.
Correspondence should be addressed to C.H. ([email protected]/* */).
原来用的funding都不是韩自己的钱，不容易啊。邮箱还是阿里云的。 |
n****g
发帖数: 14743 | 20 搞不定。
FACS
【在 m****a 的大作中提到】
: 是谁吃完饭没事干去跟方舟子告状？？
: http://fangzhouzi.baijia.baidu.com/article/523403
: 不久前河北科技大学韩春雨在《自然·生物技术》发表论文报告了一种基因编辑新方法
: NgAgo，在国内轰动一时。被《知识分子》作为末流学校土博士也能做世界一流科研的
: 典型，国内其他媒体随后跟进宣传，甚至称之为“诺贝尔奖级”的研究成果。
: 这几天我陆续收到几家实验室的研究人员的来信，反映重复不出韩春雨论文中最关键的
: 图4结果（切割基因组，T7E1和测序），呼吁我关注一下这事。
: 有些人已在网上生物专业论坛公开讨论此事，报告他们没法重复该实验，询问有谁重复
: 出来了。目前还未见有人反映重复出了图4结果。有的能够重复论文中的图3结果（FACS
: 和Western Blot），但那有可能是假阳性。
|
|
|
b***g
发帖数: 110 | 21 具体的名字我朋友也没说过，我可以去问问看
【在 C****5 的大作中提到】
: 哪个二院，哪个黄主任？
|
h*********c
发帖数: 26 | 22 裁剪基因这么多年，韩的文章确实有问题。Fig4 假的太厉害。 |
f****t
发帖数: 22 | 23 其实我一直都没想明白，为什么别人用agarose和EB做的事情，到了NgAgo就要用PAGE和
银染。
银染定量及其不准，反应太快，太容易类似“过曝”，提高小概率事件的比例。
另外，单独转染oligo出现对应蛋白表达下降，难道不就是antisense effect？
【在 j*********g 的大作中提到】
: 原来高超的实验技巧就是要避免细胞被支原体污染呀。长见识了。
: 韩春雨每天转进一次：
: 开始是重复出来的都低调，不站出来；
: 后来又受了mitbbs的启发，说是磷酸化要自己做，不能公司合成。（公司合成的效率还
: 不如自己用T4PNK催化？他文章也压根没提，就是顺着别人说。）
: 现在又是别人的细胞污染了。
: 这样的理由他还可以继续找下去，比如石家庄雾霾比较严重，国外实验室没有雾霾，雾
: 霾促进NgAgo活性。真是胡闹够了。当初小保方面对质疑，也是不断用各种细节搪塞的
: 吧。
: 记住：他文章里面测试了50个位点切割基因组，每个都work，效率至少20%。这样的效
|
l*****7
发帖数: 8463 | 24 你可能也不明白为什么一个曾经的， 当时最先进的机算机就是一个房间大小， 而且速
度很慢。
【在 f****t 的大作中提到】
: 其实我一直都没想明白，为什么别人用agarose和EB做的事情，到了NgAgo就要用PAGE和
: 银染。
: 银染定量及其不准，反应太快，太容易类似“过曝”，提高小概率事件的比例。
: 另外，单独转染oligo出现对应蛋白表达下降，难道不就是antisense effect？
|
f****t
发帖数: 22 | 25 我更不能理解的是，在21世纪号称最有希望的CPU里面用的是晶体管。
【在 l*****7 的大作中提到】
: 你可能也不明白为什么一个曾经的， 当时最先进的机算机就是一个房间大小， 而且速
: 度很慢。
|
F**M
发帖数: 11 | 26 体内重复三次，和对照没有明显区别。 体外没有看到切DNA。对我们小实验真是浪费时
间和钱，只能停下来等大实验的重复结果。要是最后证明是真的，只能说明我们确实是
技不如人。要是假的，只能骂人了。 |
H****y
发帖数: 2992 | 27 毕竟还没结果吧？这个方舟子也是个落井下石的家伙。
http://fangzhouzi.baijia.baidu.com/article/523403
韩在哪里骂人了？有知道的请share链接。 |
o*****p
发帖数: 2977 | 28 被人质疑检查到这份上还没个靠谱的回应的，100个里面99个是有问题的。
FACS
【在 m****a 的大作中提到】
: 是谁吃完饭没事干去跟方舟子告状？？
: http://fangzhouzi.baijia.baidu.com/article/523403
: 不久前河北科技大学韩春雨在《自然·生物技术》发表论文报告了一种基因编辑新方法
: NgAgo，在国内轰动一时。被《知识分子》作为末流学校土博士也能做世界一流科研的
: 典型，国内其他媒体随后跟进宣传，甚至称之为“诺贝尔奖级”的研究成果。
: 这几天我陆续收到几家实验室的研究人员的来信，反映重复不出韩春雨论文中最关键的
: 图4结果（切割基因组，T7E1和测序），呼吁我关注一下这事。
: 有些人已在网上生物专业论坛公开讨论此事，报告他们没法重复该实验，询问有谁重复
: 出来了。目前还未见有人反映重复出了图4结果。有的能够重复论文中的图3结果（FACS
: 和Western Blot），但那有可能是假阳性。
|
H****y
发帖数: 2992 | 29 没有规则说被质疑的东西，如果是真的，就一定可以在短期内解释。韩有可能是自己做
出来就发了文章，而且我估计他应该也重复成功过。我们现在要求他做的，是来解释“
为什么别人都做不出来”，这其实不是一个小问题。韩要是赖皮，就会说：我反正做出
来了，该说的也都说了，你做不出来我咋知道？当然大家还是尽量希望能最好的
justify自己的成果了。
对于重复不出来的人，有情绪是可以理解的，但是我们还是应该在定论出来之前，stay
cool, stay professional。有证据才下结论，没有证据说明造假，即使别人都重复不
出来，也不能说人家造假。这才是科学的态度。
无论最后什么结果，我都不欣赏舟子这种急于落井下石的心态。就像很多人，专门喜欢
批评别人的文学作品（比如王朔骂金庸），好像只要能找出别人的过失，自己就比写了
几十万字的人水平还高。你自己写个试试？"Pay no attention to what the critics
say; there has never been set up a statue in honor of a critic.: ~ Jean
Sibelius 我永远对干实事的人都是最佩服的，哪怕不小心犯了错误，只要不是真的诚
心造假。
【在 o*****p 的大作中提到】
: 被人质疑检查到这份上还没个靠谱的回应的，100个里面99个是有问题的。
:
: FACS
|
m****a
发帖数: 270 | 30 细胞污染之类的话有谁信？
乐观得讲现在无非是两种可能，一种是韩隐瞒了关键的技巧，为发表声称的 smart 2.0
版争取时间。
第二种就是NgAgo能切质粒但是切割基因组的效率极低（<1%），可能是体内ssDNA 不稳
定，loading 有些tricky，总之完全没达到文章中声称的CRISPR同等水平，以至于需要
用银染才"可能"看到T7E1的条带。
效率太低，导致直接测序或者或者单克隆以后测序看不到indel，很可能需要做deep
sequencing。 |
|
|
j*********g
发帖数: 463 | 31 他文章里面测试了51个位点切割基因组，每个都work，效率15%-50%.
-
.0
【在 m****a 的大作中提到】
: 细胞污染之类的话有谁信？
: 乐观得讲现在无非是两种可能，一种是韩隐瞒了关键的技巧，为发表声称的 smart 2.0
: 版争取时间。
: 第二种就是NgAgo能切质粒但是切割基因组的效率极低（<1%），可能是体内ssDNA 不稳
: 定，loading 有些tricky，总之完全没达到文章中声称的CRISPR同等水平，以至于需要
: 用银染才"可能"看到T7E1的条带。
: 效率太低，导致直接测序或者或者单克隆以后测序看不到indel，很可能需要做deep
: sequencing。
|
o*****p
发帖数: 2977 | 32 分子实验一般都是非常难以“重复不出来”的。你先搞清楚这个前提再来讨论。
他自己没问题，就根本不存在“落井下石”这种状态。他在井里，那别人的质疑变成
落井下石，只能怪他自己。
科学和宗教迷信的不同，就在于质疑和可重复性的要求，对宗教是损害，对科学却是
推动进步的力量。
方舟子和其他人的质疑对科学只有好处。
stay
【在 H****y 的大作中提到】
: 没有规则说被质疑的东西，如果是真的，就一定可以在短期内解释。韩有可能是自己做
: 出来就发了文章，而且我估计他应该也重复成功过。我们现在要求他做的，是来解释“
: 为什么别人都做不出来”，这其实不是一个小问题。韩要是赖皮，就会说：我反正做出
: 来了，该说的也都说了，你做不出来我咋知道？当然大家还是尽量希望能最好的
: justify自己的成果了。
: 对于重复不出来的人，有情绪是可以理解的，但是我们还是应该在定论出来之前，stay
: cool, stay professional。有证据才下结论，没有证据说明造假，即使别人都重复不
: 出来，也不能说人家造假。这才是科学的态度。
: 无论最后什么结果，我都不欣赏舟子这种急于落井下石的心态。就像很多人，专门喜欢
: 批评别人的文学作品（比如王朔骂金庸），好像只要能找出别人的过失，自己就比写了
|
f****t
发帖数: 22 | 33 用银染得出的结果不信也罢
倒是测序结果难以解释
【在 j*********g 的大作中提到】
: 他文章里面测试了51个位点切割基因组，每个都work，效率15%-50%.
: -
:
: .0
|
