k****o
发帖数: 589 | 1 像楼上说的，tag和actin之间加段短的酶切位点。
你的actin抗体显然不适合直接pulldown GFP-actin融合蛋白。 |
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b******s
发帖数: 5365 | 2 老板想叫我接着实验室里一个学生做的课题，但听说她做的这个蛋白只能从一个方向被
pulldown，换了bait和pray后就不行。我想知道除了假阳性外可能有其他什么原因吗？
能做的是膜蛋白把细胞内蛋白IP下来，相反就不行-----会不会是lysis buffer不能很
好地分离膜蛋白的问题？但是这个蛋白只有一个transmembrane domain，按理应该不成
问题的啊。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 3 首先，这种实验是需要做上至少3次，每次跑两个胶，平均之后才能当真的。
否则随便一个WB or pulldown 就有一大堆误差。
另外，如果你在加cycloheximide 的时候换了溶液，那么出现这种情况太常见了。
快。 |
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c***y
发帖数: 615 | 4 知道heparin可以用来purify transcription factor. 最近看的一片文章里， heparin
与 target RNA 共同加到cell extract里， 想问一下， 这样是为了减少非特意性结
合吗？ 多谢。。。 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 5 heparin is like DNA in terms of charge, so lots of transcription factors
like to bind heparin.
heparin |
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c***y
发帖数: 615 | 6 这里已经有target RNA, 再加heparin是为了降低背景吗? |
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e****s
发帖数: 1125 | 9 单纯的蛋白蛋白interaction,我个人喜欢pulldown，因为下步Western不存在IGG干扰的
问题。不过Mass Spec就不知道了。建议是Imidazole特异洗脱，别用SDS buffer直接洗。
Myc做Co-IP还是不错的Tag，而且看见过几篇mass spec based proteomics用Myc. |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 不需要阿。
可以用cycloheximide + Westernblot
MG132 + 6xHis-ubiquitin pulldown |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 这里应该是指用serum free 的培养液来冲调cycloheximide (usually dissolved in
DMSO), 然后再加进原有的培养液里（就是不换液）。在我的经验中这样是可以的，只
要加进去的东西不要超过总体积的20%。
至于说加药到18小时，这个就要赌运气了。在大部分情况下，我不会相信任何超过12个
小时的数据，因为细胞都开始调亡了，谁知道蛋白的变化是什么造成的啊？
对于半衰期特别长的蛋白，标准做法是用同位素标记法。
另外，再多说一句，对于半衰期特别短的蛋白，同位素标记法其实不是一个好方法（除
非是体外转录直接加到反应液体里），因为标记需要至少半个小时到一个小时，其实并
不是一个真正的instant pulse，再加上immune pulldown 本来就不是容易重复的量化
手段（实验的随机误差很大），对于短寿命的蛋白测出来的数值很不可靠。所以这个方
法只对于比较长寿命的蛋白适用。
。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 13 这跟用啥pull down没关系吧。你做cell extract当然都要加，
除非lysis buffer很强 |
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m******t
发帖数: 109 | 14 sigma protocol does not mention protease inhibitor at all (i use sigma M2
beads).
and samples need to rotate at RT for 1 hour.
that is why i asked |
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T*****u
发帖数: 3257 | 15 totally depends on the stablility of your protein. |
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r*******y
发帖数: 48 | 16 Interestingly. Depending on how they interaction relies on DNA.
BTw, how did you get this conclusion? they did not have any physical
association in pulldown assay? |
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r*******y
发帖数: 48 | 17 To go further, you need to first confirn your current findings in different
ways. Some suggestions:
1. Do GST pulldown, to make sure there is little or no direct interaction
between them in vitro;
2. consider if the addition of DNase, which is also a protein, will directly
interfere with the physical association between these two proteins. In
other words, if DNase reduces the physical association only via chromatin/
DNA degradation but not other ways.
if you confirm that these two proteins are p... 阅读全帖 |
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C**1
发帖数: 57 | 18 我将靶基因与Strepdavidin tag 融合表达质粒转染在293T细胞，然后准备通过蛋白免
疫沉淀方法找到与靶蛋白相结合的蛋白复合物。第一次做这个实验，想问问有经验的用
哪个公司的Streptavidin beads效果最好？Perice 的还是invitrogen的Dynabeads&#
174; M-280 Streptavidin？谢谢！ |
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k*****n
发帖数: 323 | 19 invitrogen 的磁珠。话说我没收他们的黑钱；） |
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f*********9
发帖数: 258 | 21 用crispr／cas9
给这个蛋白的chr上加个tag然后做RNA IP
或者用biotin label 的oligo pulldown RNA 核protein 做protein seq |
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r**a
发帖数: 121 | 22 谢谢各位的建议。
目前，我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
我们第一步，只是想证明这个是RNA binding的蛋白
我们目前有一个myc tag的蛋白，在转在果蝇里面（我们是做果蝇的），而且是
functional的，所以可以用这个抗体，但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA （我
不知道能不能尝试，用oligo dT的beads，pulldown，能不能拉下我的蛋白？）
还有一个，我们已经在那个HTH motif做了点突变，有几个突变体有很好的现象，
所以我们还想进一步证明，这个作用是通过这个区域进行的。
所以，只要是一个体外的实验，证明上面两点就可以了。
midwestPhD大哥的方法不错，就是我个人对这个EMSA有点怵（听说挺麻烦的），以前硕
士的时候帮一个师兄一起搞过，没有做出来。 |
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h******h
发帖数: 1257 | 23 如果是yeast的话可以试试用tagged U1A去pulldown对应的mRNA然后看看你的蛋白在不
在mRNA上面 |
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m******5
发帖数: 1383 | 24 小弟现在正在做Chip
所用抗体IP effeciency尚可
目前打算用此抗体做Chip,不过问题来了，sample crosslink, lysis， 以及dilute后
用Beads-antibody pulldown，之后用protein loading buffer煮30分钟后上SDS-page.
跑SDS-page后目的带附近什么也没有。 同一块胶的阳性对照也正常
input目的带也没有跑出来
请问有同学遇到过这种问题么？
补充说明一下，Chip所用材料是invivo knock in了一个tag的老鼠的组织。 |
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z********i
发帖数: 610 | 25 也许不是唯一的。前面有个哥们大厨的比喻很好。你仔细看看james的两大成就，方法
都是大家天天用的，但是他的思考问题的角度却很独特。
K63就不说了。DNA SENSOR大家想到的都是能结合DNA,那肯定就拿DNA 去做pulldown，
拉下来的蛋白就是了。james却不这样想，他设计了一个巧妙的function assay，所以
他找到了。
Chen |
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m******5
发帖数: 1383 | 26 听起来很有道理个啊
光用DNA pulldown其实就是个reverse screening
但加上function assay就变成了forward screening了
证明forward screening才是王道 |
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e****s
发帖数: 1125 | 27 这应该是pull down 而不是IP.
Non-specific binding 很正常，特别是His-tag pulldown
首先看看his蛋白Bait本身结合到beads怎样。
其次，如果bait本身信号弱，增加表达量。
再次，摸洗涤条件
最后一个问题，你怎么洗脱的？ |
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g*****s
发帖数: 1016 | 28 各位前辈，
小弟最近用magnetic beads (coated with steptavidin)去pull down biotin ssDNA.
在pulldown以后，我有一步工序是加热beads到80摄氏度。我发现streptavidin会从
bead上脱落下来。我洗过很多遍，都是一样的问题。我想知道有没有什么方法能够阻止
这种脱落，谢了！ |
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g*****s
发帖数: 1016 | 29 我在pulldown的时候 就是加的过饱和的biotin。不过incubation之后，我在常温下洗
了几遍 然后加热的。
streptavidin |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 你说的这个实验其实适合用Phage display or ribosome display 来做，然后再上NGS
来看pulldown result.
the |
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l****y
发帖数: 398 | 31 我估计他是已经知道一种组合会bind，就是看看mutation的影响，
Display好像有点大才小用。
[在 sunnyday (胖头鱼。按斤卖就赚了) 的大作中提到：]
:你说的这个实验其实适合用Phage display or ribosome display 来做，然后再上NGS
:来看pulldown result.
:the |
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K**R
发帖数: 193 | 32
NaCl
水平有限， 根据我经验是，
reverse 16有点长，12小时可以。
楼上朋友说对，37度是用RNAase消化的，PK至少50 2hr
最后纯化我没用过传统方法，都是zymo 的ChIP Kit 很方便
还有就是inspect自己抗体是不是effective pulldown targets
第二，检测自己beads 是protein G或者A? 因为根据一抗而定，有些primary 对G敏感
，对A差
反之毅然 |
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z********i
发帖数: 610 | 33 首先我用IP找到了他们相互作用的domain，一个是全长，另一个蛋白是一个domain；然
后在体外表达并纯化了这个单白，pulldown和native gel，都能都看到很强的相互作用
。作用的位点也找到了，突变之后能减弱相互作用。 |
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发帖数: 1 | 34 离心机转速设置不是常识，是经验。低速可以是pulldown实验来的经验，高速可能是浓
缩或者梯度层析得来的经验。实验不一样，经验当然也不一样。至于常识则是：实验遇
到不熟悉的材料，要想到先读说明书。
一般只要仪器设置未出说明书提示的范围，文章不专门注明也没问题。但这是在试验完
全使用commercially available材料按照标准化流程操作的前提下。一篇把新技术方法
做卖点的文章，写得不够详细已经是问题了，再要刻意隐瞒完全可以考虑撤稿，要是还
搬出常识这样的字眼攻击尝试者的经验，那简直就是无赖。 |
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p***o
发帖数: 1252 | 35
initial charge sharing -> output drop to below Vdd -> weak PMOS
gate input rise to Vdd-Vthp -> weak PMOS off -> floating!
你再想想？加了weak inverter相当于一个latch，有两个稳态。
难道不是这样么? rising delay 确实会受 pulldown network里internal node的影响。
电容无穷大delay就会无穷大。当然一般情况没这么极端。 |
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a********e
发帖数: 669 | 36 一个hiv inhibition的实验室
基本工作是：构建表达纯化蛋白，做一点pulldown或者其他基本的生化in vitro实验，可
能会参与一些结晶的工作；
新实验室，大概5年左右的，研究相比较下面的那个还是理论化一点
老板postdoc的老板是peter kim，现在的merck技术部门的president，不知道推荐信是不
是对去merck管用
另外一个pharmaceutics lab:
基本工作：合成polymer，然后做细胞检测这个polymer是否有用
老板是utah pharmaceutics的professor，paper一般吧，不是很牛的，但在这个领域倒是
已经很长时间了，和industry没有听说有很多的联系
本人biology background,北大学的那点化学早就九霄云外了，但是不喜欢academia的生
活，想找工作。第一个符合自己的background，第二个的话需要学polymer chemistry的
东西，但是好像更实用一点
请教各位，不知道在公司那种更稀缺或者那种更popular呢？
多谢多谢！ |
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i****f
发帖数: 473 | 37 ☆─────────────────────────────────────☆
anticipate (bio||栖身Utah) 于 (Sat Mar 25 20:21:05 2006) 提到:
一个hiv inhibition的实验室
基本工作是：构建表达纯化蛋白，做一点pulldown或者其他基本的生化in vitro实验，可
能会参与一些结晶的工作；
新实验室，大概5年左右的，研究相比较下面的那个还是理论化一点
老板postdoc的老板是peter kim，现在的merck技术部门的president，不知道推荐信是不
是对去merck管用
另外一个pharmaceutics lab:
基本工作：合成polymer，然后做细胞检测这个polymer是否有用
老板是utah pharmaceutics的professor，paper一般吧，不是很牛的，但在这个领域倒是
已经很长时间了，和industry没有听说有很多的联系
本人biology background,北大学的那点化学早就九霄云外了，但是不喜欢academia的生
活，想找工作。第一个符合自己的backgro |
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m*****i
发帖数: 1205 | 38 如果不考虑贴图一类只有WWW下才能工作的东西, 那么, telnet界面
显然要比WWW简单明了, 而且速度快. Simpler is better.
关于贴图的问题, 象现在这样, 把图放在其它网站上, 然后提供link
在这里, 用WWW时自动load, 虽然大家看起来很fancy, 但实际上在侵占
别的网站的network bandwidth, 这种行为很多网站都是不允许的.
而WWW界面还有另外一个问题, 许多用UNIX系统的网友, 用netscape
时是无法看到buttons或者pulldown menu上面的中文的. 虽说netscape6.0
perview 看似解决了这个问题, 但其仍在preview期间, 且bug无数,
是否WWW界面要注意到这个问题?
请问新的WWW界面打算提供什么新的功能呢? |
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w*******y
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w*******y
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w*******y
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.4W (AC240V)
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w*******y
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analysis, Cinema Mode 24 fps (3:2 Pulldown), Built-in ATSC/NTSC tuning
allows for tuning of standard cable channels as well as off-air digital
broadcasts, in addition to digital "cable-i... 阅读全帖 |
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