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全部话题 - 话题: pulldown
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k*******d
发帖数: 237
1
Not really. Drop down box is implemented by syntax of
h****r
发帖数: 2056
2
It works. hahha
the problem is very funny.
cause I set autonumber for my table records, and later i deleted the first
five records, so the autonumbre begins from 6, that is why i cannot get the
value shown up. because my option value passed to asp begins from 1 to 3.
whatever. thanks all.
btw, why do I always make this kind of stupic mistake. too careless.
在 huster (huster) 的大作中提到: 】
k*******d
发帖数: 237
3
Usually, it will take 3 times longer time for debugging and maintaining the
code than writting the code. Which will let programmers always have work to do
number.
k****i
发帖数: 838
4
来自主题: Hardware版 - 那种3D系统好?
难怪你得出快门不好的结论,你这基本不是Native的3D,不闪才怪。
先去试试44或55 pulldown的蓝光Native Full 3D再说吧。
x***c
发帖数: 3
5
地址栏的pulldown里的地址很多, 而且不是按使用频率排序的。
怎么能编辑这里的地址, 比如删除, 重排。
r*****k
发帖数: 9
6
来自主题: Security版 - 紧急求救:如何清除LMMIB20.DLL?
1. Click Start and then Run
2. Type "regedit", then click OK
3. In the "Registry Editor" window, pick Find from Edit pulldown menu
4. In the pop up "Find" dialog box, type "LMMIB20.DLL" , click "Find Next" to
find the relevant entry, and delete it.
5. Close "Registry Editor"
6. Click Start and then Search" and then For Files or Folders ...
7. Type "LMMIB20.DLL" again and set Look in to be "Local Harddrives "
8. Delete any relevant entries.
s******y
发帖数: 28562
7
没有什么好办法。
要么换一个抗体,要么就换一个tag, 要么就换用anti- proteinB 的抗体
来做pulldown
s******y
发帖数: 28562
8
来自主题: Biology版 - 有没有磨细胞的微型管?
我们需要homogenize 一批量很小的放射标志过的cultured cells,
并把chromosome DNA 打碎(好来做pulldown).
但是用sonicator 或者针头都不是很好的选择,因为sonicator 容易把样品
溅出来,而针头会有很多残留,不是很适合做quantitative analysis.
我知道有一些cell shredder的小管子是用来制备RNA sample的,可以把
细胞完全裂解。不知道有没有类似的东西可以用来裂解细胞制备总蛋白的?
有没有人知道? 谢谢了!
s******y
发帖数: 28562
9
来自主题: Biology版 - 有没有磨细胞的微型管?
不行,这样不能打碎DNA, 裂解液会粘的很,不合适来做pulldown.
但是我们又不想用sonicator, 因为是放射标记的细胞。
这个大家都是怎么处理的啊?
也不能用DNase, 因为要做一个降解的非常快的蛋白,需要及时处理样品,
不能慢慢的用DNase 处理
s******y
发帖数: 28562
10
来自主题: Biology版 - 有没有磨细胞的微型管?
因为DNA很粘,会影响pulldown
e****s
发帖数: 1125
11
用含Ni的matrix做Pulldown 好了,
应该是很简单的。
e****s
发帖数: 1125
12
用含Ni的matrix做Pulldown 好了,
应该是很简单的。
e****s
发帖数: 1125
13
其实没必要
如果你只是要正是蛋白结合Ni的话,Pulldown离心以后,跑SDS-PAGE,考染就好了。
X******n
发帖数: 914
14
来自主题: Biology版 - Phosphoproteomics follow-up 求助
我也想过pulldown 后做MS,可是老板不同意,我们的MS core太慢了。
我想做10个以上的确证,如果做抗体我们做不起。
y******y
发帖数: 107
15
来自主题: Biology版 - 求一片paper 谢谢
Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown. Methods
Mol Biol. 2006;338:281-90.
可以发到邮箱 y*****[email protected]
thanks.
z**m
发帖数: 50
16
本人生物菜鸟,请教版上牛人,万分感谢!!!
想检测老鼠体外培养细胞中病毒感染前期,病毒RNA是否和目标蛋白结合成RNP complex。
目标蛋白IP抗体available,想检测的viral RNA 为40-50 nt的leader sequence (
LeRNA)。
做了些homework,准备用目标蛋白pulldown,PK处理,纯化RNA组分,northern检测。
问题:
1)由于个人原因,不想用同位素标记探真做northern,不知可否用dig-probe做
northern,主要担心RNA量太少,不知道dig的灵敏度是否足够。
2)由于目标RNA只有40-50 nt,请问northern 的DNA或RNA probe是否只能是这40-
50nt的序列?如果probe只有40-50 nt,是否太短?尤其是用dig-UTP标记?可否适当
延长probe至200 nt-300nt(后续sequence是病毒的另外一个高表达基因,如果该基因
mRNA也和目标蛋白结合最好,如果不和目标蛋白结合,是否延长的probe检测不到40-50nt的leRNA?)
3)除了northern,
s******y
发帖数: 28562
17
By the way, my coworker told me, the Penta-His antibody from Qiagen is
verygood for immuno-pulldown if you really need to do it this way.
s******y
发帖数: 28562
18
There is back-ward and forward screening methods
For forward screening, you can do crosslinking and pulldown of candidate
proteins, and then send the products for mass spec
For back-ward screenings, you can use random KO library (usually with yeast)
to select the clones that are resistant to your ligand (with proper
screening assay), and then figure out what gene is required for the signal
pathway.
Either way it is not a small work

surface
a***e
发帖数: 1010
19
in these cases, both HA and IgG are background controls. Theoretically,
both of them should have no pulldown signals at all (= 0). If you divide
something by HA or IgG signal, any little variation will change your ratio
dramatically. So, neither of them is the right normalization.
A good normalization method is using 1% input as a control.
However, the best normalization is using some internal controls that are not
changed by your treatment. For example, your TF binds gene GAPDH and gene
X.
t*******k
发帖数: 87
20
来自主题: Biology版 - ubiquitin 单体聚集的问题
困扰很久了,想请教做ubiquitin的大牛:
把纯化的ubiquitin单体SDS电泳,考染一条带没问题,但用ubiquitin抗体做western,
总有一条大小为diubiquitin的条带出现,关键是这个条带在后续的pulldown实验中被
富集,不知道ubiquitin是不是能够自动聚集成多体啊,可能是非共价连接吗?谢谢
m******h
发帖数: 32
21
来自主题: Biology版 - ubiquitin 单体聚集的问题

##不是大牛,但是跑过这个胶,呵呵,##
##我用12%的胶也没有带,后来换到15%就看见了。##
但用ubiquitin抗体做western,
被富集,
##关键是看你用什么来pulldown吧?##
不知道ubiquitin是不是能够自动聚集成多体啊,
##应该不会吧,没有酶催化的话。##
可能是非共价连接吗?谢谢
b****u
发帖数: 903
22
来自主题: Biology版 - 关于co-ip的!
多谢各位的建议,crosslink我也曾经try过,就是重复不了别人的实验,人家内源也可
以pulldown,咱们overexpressing都不行,差距那叫一个大啊。
BTW,可能不同lab做COIP的时候的buffer条件不一样吧。
s******y
发帖数: 28562
23
Yesh, for example you can use IP on endogenouse proteins
For the protein domain things, you can use the recombinant domain of A to
pulldown the endogenous proteins B
s******y
发帖数: 28562
24
well, in this case, you can check with the other endogenous protein which is
not supposed to have interaction with A, and see if they also get pulldown.
m***n
发帖数: 337
25
yes, I will do that.
your point is: if I only overexpress one protein, it would be better than
expressing both, right?

which is
pulldown.
s******y
发帖数: 28562
26
try to check if there is difference in PI value between your protein and the
GST protein. If there is, then you can use ion exchange column to seperate
the GST protein and your GST-fusion protein after the glutathione-resin
pulldown.
k*********a
发帖数: 49
27
土鳖的问一句:如果俩蛋白mw差得比较多,IP完了之后为啥要用ab看是否能被pulldown
,直接autoradio有prey何bait两条band不行么

W****C
发帖数: 1937
28

pulldown
爱惜生命 远离放射源:)
W****C
发帖数: 1937
29

pulldown
不幸, 我这两个蛋白分子量差别只有1KD. 不过这也不影响用S35, 可以只标记其中一
个。 主要还是辐射污染。 用了放射性的, 每一步都变得很麻烦 很小心。。。
s****l
发帖数: 395
30
primer合成时加biotin,一般可以到80nt,DNA大小限制应该不大,几kb应该都能
pulldown下来的
T**********t
发帖数: 1604
31
你和nanog是分身啊?
Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown
Kenneth K. Wu
Gene Mapping, Discovery, and Expression
Methods in Molecular Biology, 2006, Volume 338, 281-290, DOI: 10.1385/1-
59745-097-9:281
http://www.springerlink.com/content/j274505582u54474/fulltext.p
m********r
发帖数: 124
32
来自主题: Biology版 - 课题换得太累了,还换不换?
我们是做生化的,体外纯化蛋白,做相互作用(fluorescence,ITC,pulldown),
顺便做点结晶和核磁,mapping作用位点。我第三年下了。
Rotation 的时候做一个真核信号通路蛋白的A domain(这也是老板postdoc做的
domain),是个很好纯化的蛋白,做的还行,有个coauthor的paper(师兄一作,4分左
右,话说我觉得实验室就这个水平了)。
加入实验室之前,另外一个rotation的学生做B和C蛋白,是原核的信号通路。当时
我感觉我加入实验室是不就做这个了。结果老板让我先做D和E, 顺便做原来的真核蛋
白的F domain,理由是应用的技术是一样的,要charaterize的蛋白性质也是相同的。
这是实情。这个时候有个小的grant, 关于蛋白BCDE的。结果我第二年冬天发现F
domain太大,不好做。而D和E表达起来比较困难,不可溶。加上B和C合作者有genetics
的data,所以就做了点这个。之后回国,春天回来做助教,上课考qualify,几乎春季
没做实验。完了之后,发现D和E 已经被马普的两个组发了。人家一... 阅读全帖
s******y
发帖数: 28562
33
来自主题: Biology版 - 土问:histag 只有5个his行吗?
如果只是做标记信号可以,因为有些抗体其实就是针对5xHis 设计的,
如果想用来pulldown 那应该不行
n**8
发帖数: 221
34
来自主题: Biology版 - RIP 菜鸟求助
本人分子生物学菜鸟。。。
在做RNA-IP, 想用特异性的抗体把一个细胞核内的蛋白(RBP)binding的RNA pulldown
下来,
试过几种buffer,但是都不理想,
用过RIPA buffer 虽然可以IP到目标蛋白, 但是好像RBP-RNA complex 被打散了。RNA
没有被
IP下来。。。
2006年的两篇Nat protocol 文章用到Polysome lysis buffer去IP RNA。
(Peritz et al., 2006; Keene et al., 2006).我也试了一下,发现目标蛋白没能IP下
来,
连IP input WB 也detect不到这个RBP, 猜测lysis条件可能太gentle了,核膜没有破。
请教有RIP经验的大侠,有没有其他的好用的RIP buffer?
Any suggestions are appreciated!
不甚感激!
a********k
发帖数: 2273
35
来自主题: Biology版 - RIP 菜鸟求助
看标题还以为是rest in peace呢,心想这活还能求助啥呢!

pulldown
RNA
e****s
发帖数: 1125
36
你的Pulldown结果表示这些是一个大的Complex,
这可能会是一个比较复杂点的课题。只要A和BCD中任何一个有Interaction,都可能把3
个蛋白都拉下来。甚至还有其他的Player,因此理论上,A和BCD都不结合甚至都可能把
他们拉下来。
要是我,我会先盯着A和B做。最好的办法是用Purified protein来PD,也只有这样才能
证明是direct interaction。因为你在in vivo能把B拉下来,所以如果AB是直接相互作
用的话,在In vitro,应该也能PD下来。
m******5
发帖数: 1383
37
来自主题: Biology版 - Re: chip, TF binding 多强才算数?
Thank you much for your great contribution to my rookie question^^
I think non-related region negative control is convincing theoretically, if
not taking non- specific DNA precipitation into account: different DNA
region might have different tendencies of non specific precipitation (I also
learned that this issue can be simply avoid by using dynal beads)
A parable phenomenon is that when I was doing invitro protein interaction
assay such like GST pull-down and co-ip, the reviewer did not questi... 阅读全帖
s******s
发帖数: 13035
38
来自主题: Biology版 - 请教:ChIP抗体的dilution
我自己没做过。不过实验室做chip-seq的时候,一般做几个浓度,
取pulldown DNA的量刚好plateau的浓度

Pol
10cm
S******e
发帖数: 393
39
来自主题: Biology版 - 问个两蛋白相互作用的问题
假如蛋白A(400kD)和蛋白B(40kD)有binding,
那么在做pulldown时,是否会大蛋白拉小蛋白容易,而小蛋白拉大蛋白难些呢?
还是根本没区别,不受大小影响呢?
THX!
g*********5
发帖数: 2533
40
来自主题: Biology版 - protein G beads 冻后还能用吗
thanks, and whatever take a look about the pulldown result.
m*p
发帖数: 226
41
用一家公司的单抗 (mouse IgG) 做CrossLink Immunoprecipitation. 银染和靠马氏良
染结果都很好。 主带(target protein) 很明显出现在正确的位置, 而且抗体的
pulldown比对照IgG多很多条带。 所以送到一家公司protein identification. 有大约
40个蛋白只出现在样品里,而对照没有。
根据Mass-Spect 的结果,奇怪的是主带(target protein)居然不是这个抗体识别的蛋
白, 虽然大小根这个识别的蛋白是一样。其实这个应该识别的蛋白就根本没有被检测
到。
于是我拿这个抗体去做wb 和 ihc。 发现ko 的样品还有这个蛋白,没有比对照少。我
很确信ko,因为phenotype 很明显,Q-PCR 证明85%-95% ko.
我怀疑这家公司在制作抗体的过程中,根本没做antibody validation, 或者做了,认
为size一样的就是正确的抗体。
我花了大约7000刀,4个礼拜的时间。 我能叫他们赔偿吗?
我不知写清楚没有。 谢各位的反馈。
l***g
发帖数: 19
42
如果蛋白A和蛋白B结合,用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体
外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性,但是如果用A-His6就检测
不到B-His6酶活性的上升,所以我的问题是,A-His6和B-His6也能结合吗,会不会由于
His6带有正电,两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。
W*********e
发帖数: 247
43
GST可以二聚, 有可能是二聚促进了pulldown和酶活. :)
但是没理由6p3载体表达出来的比5的少, 还降解

也试过切gst,但是切后纯化,再去掉factor xa,所得到的蛋白实在太少了,想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶,用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍,还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了,别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的,但是合作的实验室就非
要去掉tag,或者用his的,就为这点事情耽误了快2个月了,急死我了,实验就差最后
这一个了
l**********1
发帖数: 5204
44
来自主题: Biology版 - 蛋白互做检测: Split GFP vs FRET
Above paper its pp58
While we cannot dismiss the possibility that the split-luciferase
and the GST pulldown results are false-negatives, the interaction is
not supported by other evidence and is of lower confidence.
楼主 不会用排列组合吗?
萤火虫萤光标记N and C terminal a class
glutathione S transferase GST b class
HA-epitope tagged c class

then a must be used
positive control group:
(a,b,c)
(a,b)
(a,c)
negative control group:
(null, b,c)
(null, b)
(null, c)
Ps: if you are satisfied to this replied. BAOZI... 阅读全帖
s*****t
发帖数: 107
45
来自主题: Biology版 - CoIP- mass spectrum 求助
小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白,然后pulldown flag
然后跑SDS-PAGE胶,但是出了很多band,请问有没有好的办法除去非特异的band。
多谢~ 5个包子
s*****t
发帖数: 107
46
来自主题: Biology版 - CoIP- mass spectrum 求助
小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白,然后pulldown flag
然后跑SDS-PAGE胶,但是出了很多band,请问有没有好的办法除去非特异的band。
多谢~ 5个包子
q*******8
发帖数: 768
47
我不觉得很简单啊。。。感觉像我们老师给研究生留的作业。。。
个人以为要先做PULLDOWN,找到有关联的蛋白,然后用YEAST2HYBRID之类印证direct
interation。这样得到的蛋白再用P32-ATP做phosphorilation.
q*******8
发帖数: 768
48
我不觉得很简单啊。。。感觉像我们老师给研究生留的作业。。。
个人以为要先做PULLDOWN,找到有关联的蛋白,然后用YEAST2HYBRID之类印证direct
interation。这样得到的蛋白再用P32-ATP做phosphorilation.
s******y
发帖数: 28562
49
如果你要认真做的话,应该这么做:
用anti-GFP 来pulldown GFP-actin, 或者直接在细菌里表达GFP (or GFP-actin, 没有
活性没关系,反正是用来western), 或者直接到公司买点GFP standard protein
sample.
然后先跑胶用蓝染或者银染,对照已知浓度的BSA 来测定浓度,然后用这个GFP (or
GFP-actin)来作为标准浓度来对比你的细胞里面的GFP-actin来估算浓度。
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