X***n
发帖数: 366 | 1 DH5a or Invitrogen Stbl3? It says Stbl3 is better for retroviral vector. |
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T**********r
发帖数: 287 | 4
多谢回复，这个正是我考虑的一点，但我这样设计的依据有两个：
1.CMV promoter可以drive shRNAmir的表达，见图1,干扰效果，CMV与H1和U6效果一样
。文章为
2005年nature genetics的Second-generation shRNA libraries covering the mouse
and human genomes.
2.Openbiosystem shRNAmir的设计采用相似的策略。CMV/tuboGFP/IRES/puro
R/shRNAmir,也是一个CMV promoter驱动两个蛋白和一个shRNAmir同时表达。见图2。 |
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z****g
发帖数: 3340 | 5 人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望. |
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s******r
发帖数: 2876 | 6 你这个virus以前用过吗？肯定work吗？
人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望. |
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z****g
发帖数: 3340 | 7 以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好. |
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l*****i
发帖数: 1163 | 8 还有Puro不建议持续加，先加一天，然后长长，再加。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 9 那你可以先用普通的细胞，比如293，来试试你的病毒，
不用加drug，感染后，western先看看。
以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好. |
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b****h
发帖数: 18 | 10 本来不怀疑这一点，但有同事说G418适用于杀死能增值的细胞。我最近打算赋予特定类
型的 neuron具有neo或puro的抗性，然后杀死其他类型的neurons和杂细胞。有哪位做
神经的兄弟用过G418或PUROMECIN筛选/杀死neuron的经验吗？我指的是元代老鼠或人的
neuron。多谢！！！ |
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H****s
发帖数: 301 | 12 It depends on your purpose and the cell line to be transfected. Generally
speaking, if you cell line is tough enough, puromycin is much easier to work
with. You just need to add a relevant amount of puromycin to the media and
it starts killing.
For neomycin and hygromycin, you have to determine optimal killing
concentration specific to the cell line you will use. To initiate killing,
you have to split cells and supplement with neo/hygro containing media.
Every selective marker has its specific p... 阅读全帖 |
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z*******6
发帖数: 679 | 13 I don't think the selection marker matters a lot. I think it is the cell
line and the way of transfection that matters more. If you don't care the
expression level tooooo much, lentivirus works really good. But last time I
was doing A549 and I need the expression level to be really high to secrete
a lot of soluble proteins for ELISA detection, none of methods (
electroporation, nucleous transfection, lentivirus) or selection markers (I
tried multiple ones) worked. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 14 how is the blast?
this marker work well? |
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z****g
发帖数: 3340 | 15 想要一个表达vector pCDH-CMV-puro/copGFP能否分享一下，可站内交流。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 17 筛一个带tag外源蛋白的over expression stable cell line 用于纯化complex。
挑的colony在6孔板里做wb，有好几个阳性克隆。
我选了一个克隆，现在扩增到两个10cm 板了，再做wb，没有表达了（我wb没问题，有
阳性对照。）
一直都是加药的（puro）。
这是怎么回事啊？已经建好的stable cell line还会消失吗？ |
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j******i
发帖数: 939 | 18 It's not surprising that transgene is silenced after two weeks or longer
time. The reason could be inserted into heterochromatin, or methylation.
However, those colonies might still be resistant to puro because of high
density. |
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W**S
发帖数: 275 | 19 今天悲摧了，generate了一批LENTIVIRUS，结果PURO SELECT之后CELL都死了，这次着
急，没做MIDI PREP，直接用MINIPREP的PLASMID做的TRANSFECTION, PLASMID的质量不
是太好，浓度很低，260/230不太好，同一批用MIDIPREP GENERATE的VIRUS没问题。请
问LENTIVIRUS不WORK会是因为PLASMID的质量不好吗？以前也用MINIPREP的PLASMID做过
，没问题。多谢！ |
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W**S
发帖数: 275 | 20 我也是奇怪在这呢，就算TITER低也不至于一点没有。PLASMID用RE DIGESTION CHECK了
，有INSERT, 是PLKO-TET-ON LENTIVIRUS SHRNA construct, 用STBL2转的，不至于丢
了PURO啊。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 21 最近用sigma的PLKO.1-puro制备一个基因的shRNA慢病毒颗粒。于是想到这样一个问题
，到底什么样的质粒可以用来包装慢病毒呢？比如像pCDNA3.1这样的质粒，能不能包装
慢病毒从而提高转染效率呢？
可能有点白，但是还是很想知道权威的解释。多谢各位 |
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s*********t
发帖数: 600 | 22 是不是必须得用maxi？mini的质量不能做细胞转染？
另外，G418, puro没用完，是放回－20，还是可以放在4度？能stable多久？
多谢！ |
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s*********t
发帖数: 600 | 23 是吗？多谢
不过我看到有人说mini的plasmid的quality较差，因为没有去掉内毒素，有较多开环和线性，而maxi的去除了内毒素，且
多为超螺旋，更适合转细胞
还有G418和puro该怎么保存？ |
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C***Y
发帖数: 61 | 24 I am trying to generate cell line with inducible knockdown. I used Tet-pLKO
-puro, in which a puromycin resistant gene is placed downstream of pGK-TetR-
IRES. The problem I am having now is that the expression level of puromycin
resistant gene was so low that all the cells were killed by puromycin. I
heard that the single vector Tet-induicible system selling by Clontech is
not very good either. Have anyone found any system satisfactory?
Thanks. |
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b**********8
发帖数: 349 | 25
是一样的，我们一直使用的sigma 的 PLKO.1-puro-shRNA 质粒，我现在每次都是从师
姐留给我的那管质粒中取一点出来做转化然后midiprep。 |
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v*********d
发帖数: 382 | 26 刚开始的是stable clone都是transfection + selection, viral vector 是后来才有的
puro 是比较常用的的，很靠谱了。viral vector 优点也就是快，2周就搞定了，但是
表达量就要看运气了。 |
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s*******t
发帖数: 9 | 27 转染后的细胞系，puro去掉非染细胞，转后的细胞不长了，咋办？指望多点细胞收蛋白
。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 28 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 29 TRY INSERT PURO CASSET BEFORE THE Neo/kan?
600bp with GBLOCK FROM IDT.
transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在
这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经
试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 要改抗性太麻烦了。因为Neo/kan 是真核原核都能用的，要是改成puro 就必须
再找个地方插进一个原核里的基因，会把人烦死的 |
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s*****g
发帖数: 87 | 31 有做stem cell 的大侠做过 FIAU (Fialuridine) counter selection 吗？
我用的 puroΔtk selection marker， 加了FIAU（0.25uM）之后为什么细胞不死呢？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 32 一般双抗就一起加呗。G418很慢，大概要三五天才有反应，不喜欢用，Puro很快。
胞。 |
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e**r
发帖数: 1144 | 33 最近用puromycin杀细胞
发现puro超过一定浓度后（3ug/ml左右）,再增加浓度细胞死的反而越来越少了，一直
增加
到几百ug/ml,远远超过正常浓度，存活的细胞仍然是增加的趋势
最极端的，用10mg/ml stock泡了两天，存活的细胞居然比3ug/ml要多
有人注意到过这种现象没？
这是为什么？ |
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d**********t
发帖数: 20415 | 34 要表达一个200+KD的protein，带selection marker other than puro,公司搜了很多都
是要买整个system的，老板想省钱，只买一个plasmid,用实验室现有的second
generation package system
大牛门有啥好用的推荐么？ |
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d****d
发帖数: 214 | 38 T2A编码的是一个peptide，可以连接两个蛋白质的coding sequence使其转录时为一个
mRNA但在翻译时分开成为两个独立的蛋白。
以你的问题为例子，你可以在T2A上游插入你感兴趣的蛋白质的coding sequence，最终
你的蛋白和puromycin resistant gene (Puromycin N-acetyl-tranferase)所编码的蛋
白会被翻译成两个蛋白。这种同时表达多个基因的策略同IRES策略相比，好处是上下游
蛋白的比例理论上讲是严格的1：1. |
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w*e
发帖数: 740 | 40 顺便问一个，
但是2A的原理是"ribosome skip",所以在前后两个蛋白的尾巴处都多留了一个或者几个
氨基酸，难道没人怀疑过会这个也许会影响蛋白的功能？ |
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w*e
发帖数: 740 | 41 有的2A后面就是接的是功能蛋白
记得iPS的4个因子的小鼠就是这么造的 |
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s******s
发帖数: 13035 | 42 应该没啥用。根本不是一个promoter，再说puro抗性很强，对dose不太敏感。
这种实验就是做短期的，一两个礼拜内搞定。长期表达不利的shRNA或者转基因，
细胞多半就抑制表达了。有两个办法，一个是连个T2A的抗性，不过细胞其他基
因也可能变化来抵消你得影响；另一个就是做inducible的系统 |
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r***e
发帖数: 2539 | 43 作用不大，但是有可能enrich multiple copy integration。
一个细胞感染多个病毒。但是shRNA和puro表达量不一定线性。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 44 T2A
your-gene-T2A site-puro
在同一个mRNA表达，表达cDNA可以用。
google
The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A
site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’
sequences
inducible system
请参考
Wee, S., Wiederschain, D., Maira, S.-M., Loo, A., Miller, C., deBeaumont, R.
, Stegmeier, F., Yao, Y.-M., and Lengauer, C. PTEN-deficient cancers depend
on PIK3CB, Proc Natl Acad Sci U S A. 105: 13057-62, 2008
http://www.addgene.org/21915/
另外还有两载体系统
pCMV6-TetR
TO-shRNA
很多公司都有，google
你现在的stable ... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 45 非常感谢！找到了! 他们改名叫做Tet-pLKO-puro， 因为：
“The name was changed to clarify that this plasmid does not contain and is
not related to the trademarked Tet-On(R) system sold by Clontech. ” |
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m***u
发帖数: 39 | 46 在做一个transformation的实验，MCF10A细胞virus感染某个基因后puro screen 2天，
然后split到6孔板中。两三天后发现某些focus出现，但是不是很sure。有没有做过的
同行，说说你的意见? |
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h*******o
发帖数: 4884 | 47 Yep, tell your boss but strategically.
Tell your boss that when you asked for the cell, you told the postdoc
clearly that cells would be used for screening with puro resistance.
Tell your boss that you feel that you feel sad "but NOT SORRY" that months
of time could have been saved and the progress of this project could have
been much faster if there had been better communication and you were
notified about the resistance issue.
Then let your boss deal with the whole situation. |
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s******s
发帖数: 13035 | 48
你筛个单克隆出来不就行了，还是因为长的慢？不是单克隆也没啥问题啊，
平均减小误差嘛。
G418是一个烂药，除非不得已，否则应该上puro |
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j******i
发帖数: 939 | 49 克隆狠容易拿到。gRNA成功率很高，但是不同的loci效率有不同，一般设计三个gRNA，
挑其中效率最高的用。off-target是没办法的，或者用double nickase吧, 不过效率会
降低。筛选克隆的过程是麻烦了点，费时费力，一般用gfp, puro,来enrich, 不过都不
是最好的方法，各显神通吧。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 50 原来实验室做了几十种promoter，几十种各式tag或者T2A
puro一类的，要表达啥，随便找个tag，promoter，然后去
网上或者facility的library里面挖个基因clone出来，一个礼拜
就搞定，两个礼拜细胞转染好，异常方便。
坏处是，gateway那个酶巨烂，绝对用不到十次。除非
每次做多个克隆，否则用过五六次就失活了，极端怀疑
life里面有猫腻，比如偷偷加了低浓度的蛋白酶一类
很 |
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