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p*******r
发帖数: 59 | 2 谢谢大家的热情讨论，从Addgene订了Feng Zhang lab的 pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)
和 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)plasmids. 打算先用最简单的 transfection 和
cutting cas9 看看结果怎么样. 不行得话再用nicking cas9 and lentivirus.
Welcome more discussions in the future. |
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z*t
发帖数: 863 | 3 我们用32D细胞做indel，电转，addgene上的P458/459都试过。
电转效率比较低，2-3% GFP+,筛出single cell colony,里面8~9/10都有indel，不过
indel是相当heterogenous,几乎没有一样的。
puro因为电转效率太低，没有长起来。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 4 如题，人在国内，没有fedex账号（我知道考验我人品的时候到了），请问谁有MISSION
® TRC2 pLKO.5-puro Non-Mammalian shRNA Control Plasmid DNA(产品编号
SHC202)这个质粒？Sigma官网这个质粒要4000多，太贵了，哪位好心人愿意馈赠一点？
如果不方便走fedex（如果有收货方付款的话更好了），选择普通邮寄也可。非常感谢
！ |
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b**********8
发帖数: 349 | 5 特别纳闷的是细胞能耐受puromycin，证明病毒应该是转进去了，可是为什么看不到一
点点的knockdown呢，求大神分析分析 |
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s******y
发帖数: 28562 | 6
用的是同样的shRNA 以及同样的靶细胞来knock down 同样的蛋白么？ |
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b******1
发帖数: 93 | 7 我们一般一个基因买五个shRNA,基本上两个可用， 两个没效果， 还有一个是反的。个
人觉得最好还是拿别人发表的序列用，几率高点。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 9 是的，我们当初就是从openbiosystem买的，一共5个，经过验证有两个是有效的，在博
士老板的实验室用这两个做了很多数据，一直work的很好，但是换实验室后就不行了。 |
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L****T
发帖数: 169 | 11 1，把shRNA质粒送去测一下序列（国内公司一般测不出来不收钱），很可能在你把质粒
带回国重新转化抽质粒过程搞混了。
2，另外，你puromycin杀了几天？有些shRNA筛选时间长了虽然细胞还耐受puromycin但
U6会被silence。
3，自己重新再做几个shRNA呗，国内引物合成便宜。 |
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L****T
发帖数: 169 | 12 4，建议做个同时做RT-qPCR鉴定kd效果。因为不清楚你WB的band位置是否对。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 13 1,恩，好建议，我也打算这么做。
2，puromycin杀两天，未染毒的对照细胞全部死光光，染毒的细胞活的很好。
3，已经着手搞了，
谢谢你的建议！ |
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V******t
发帖数: 444 | 14 CMV promoter 在mESCs里面会沉默，对吧，比如mE14、J1，用CMV驱动表达是不行的。
但是我想用minimal MCMV promoter，前面接一个multimerized DNA binding sites，
后面表达mCherry，在ES细胞表达能结合DNA的转录因子，看mCherry。这个会有问题吗
？我的载体将会是
-DNA binding sites-minimal MCMV promoter-mCherry-PGK-puro-
如果不行。pGL4载体是用minimal Promoter，驱动luciferase，想问这个minimal
Promoter是啥？能用在mE14吗？可以用GFP换掉后面的luciferase吗，有这样的载体可
以分享／买的吗？最后得到一个这样萌萌哒的载体：
- DNA binding sites - minimal Promoter - mCherry - SV40 early enhancer/
promoter- hygro -
这个用在mE4没问题吧？
谢谢！ |
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V******t
发帖数: 444 | 15 找了一下午，也没找到。
希望是GFP／YFP等任何荧光蛋白，前面有minimal promoter 或者TATA box之类的，可
以再前边接自己想要的序列；后面有PGK之类的promoter驱动的neo／hygro／puro等任
何筛选标记。
求推荐，在线等，谢谢！！ |
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l*********i
发帖数: 332 | 16 ssDNA oligo as donor, puro screen, should be easy~ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 17 你这个strategy是指把两个selection marker，象G418/Puro，放在两个Homology-
directed repair template上，只有target gene的两个copy都edited,并且是用不同的
template repair的克隆才会在两种selection条件下生存下来，我理解的对吗？
谢谢！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 18 谢谢manlycz，giantbird05和laghs！和老板讨论下来，准备试试。这个礼拜开始准备
前期工作，测试细胞的puro浓度，但细胞长成clone的一些条件。
同样多谢上面其他网友！ |
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E*********4
发帖数: 16 | 19
PolIII
promo
谢谢你的解释！我可以问一下，为什么包装病毒后就没有H1 promoter了吗？另外，病
毒包装不成功是受了插入的这个基因什么影响吗？
是在考虑换载体。
谢谢！ |
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L****T
发帖数: 169 | 20 pLKO.1不太好改造，插入片段位置不恰当经常会影响病毒包装。 |
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E*********4
发帖数: 16 | 21
有推荐的适合做inducible overexpression的载体吗？谢谢！ |
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w*********1
发帖数: 27 | 22 Try FLIP-IN system. pcDNA5-FRT/TO |
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L****T
发帖数: 169 | 23 病毒系列的貌似Rudolf Jaenish用来做可诱导iPSC那个FUW-TetO-Oct4/...系列应该可
以，很多实验室都重复过，不过我没有亲自用过，另外这个系统rtTA没有做进FUW-TetO
里，你需要同时感染表达rtTA的病毒。 |
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E*********4
发帖数: 16 | 26
我们最后决定试试 iCumate system了。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 27 我的问题不一样：为啥要用virus delivery system呢？转化（transfection)效率低的
话，cell sorting或Puro selection不是可以解决吗？
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题，transfection后不能等太长。而cas9是permanent deletion，又不
能保证transfected cells一定有genome editing发生，这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章，一个library是针对18000个基因，另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想作这个project,找
出我们自己compound针对的signal tran... 阅读全帖 |
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m********2
发帖数: 317 | 28 我将puro换成了GFP，结果不好用了。病毒包装的时候GFP能达到90%，但是病毒不能感
染任何细胞. |
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m********2
发帖数: 317 | 29 谢谢答复
是在lentiCRISPR V2的基础上将puro更换为GFP吗?
能告诉我是那篇文章吗?
谢谢 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 30 （这个问题本来是放在另一网友的回帖里的，没有人注意或回答，就再拉出来示众。）
转化（transfection)效率低的话，cell sorting或Puro selection不是可以解决吗？
我只觉得两种情况下需要virus delivery system--
1。Pool all cells, no need to clone cell line。这个是siRNA里经常的问题。但
siRNA有时间问题（不能超过十天左右），也就是transfection后不能等太长。而
CRISPR/cas9是permanent genome editing，没有时间问题；同时又不能保证
transfected cells一定有genome editing发生，这和siRNA显然不一样。
2。deliver a library of guide-sequence-cas9-vector。这个我一直很感兴趣。最近
的两篇文章，一个library是针对18000个基因，另一个是73000个基因。这个对找一个
compound针对的signal transduction cascade还是不错的。我也想... 阅读全帖 |
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r***e
发帖数: 2539 | 31 就是将修复模板（800bp）放在同一个载体上，比如px459-puro的Not1位点？
我看标准的protocol需要将修复模板线性化，这个重要吗？
先谢谢了！ |
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l*******e
发帖数: 170 | 32 没有一手经验，貌似Feng lab的lentiCRISPR v2不错，但是看描述又说lentiGuide-
Puro双质粒系统可以得到更高的virus titer，但是必须用稳定表达Cas9的细胞系做实
验。
有经验的同学给说说，或者其他的什么系统更好。
我感觉做screening的话障碍有两个，一个是infection efficiency，二是off-
targetting effect.
另外哪里有稳定表达Cas9的细胞系卖，比如293什么的？ |
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O**********a
发帖数: 317 | 33 会整合。GeCKO不是puro筛了几天，再等几天吗
就是让gRNA整合并发挥作用。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
：大谢！
：
：........... |
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s******s
发帖数: 13035 | 34 puro和你的gene是2A在一起的，还是独立的 |
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j******i
发帖数: 939 | 36 Zhang Feng的lentiCRISPR v2正好适合你。用kpnI和BamHI消化去掉gRNA和cas9， 然后
把启动子＋你的目的基因放进去（不加polyA)，后面正好跟着2A和puro。 |
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m****p
发帖数: 122 | 37 最近在做利用lentivirus表达sgRNA KO一个基因，转染第一步就出现问题。
针对两个位点病毒是sigma定制的，寄给我的滴度是5*10^6/ml和1*10^6/ml，我用它们
转了两个细胞（12孔板，每个孔10微升病毒），该病毒正常应该有GFP及puro抗性基因
表达的，我在转染24小时和48小时居然没有看到任何荧光。
我原来用过santa cruze的shRNA病毒，转染后用puromycin筛选，转染效果还是可以的
，最后也筛选出了我要的单克隆细胞。
有人遇到过我现在这个情况吗？怎么解决？
谢啦 |
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c****1
发帖数: 1095 | 38 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
做。
先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
很多。
后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
transfection，通常每个细胞的plasmid会很多，这样Cas9的量太高了，会不会又会增
加off target的概率？
大家一般是首选什么策略？ |
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O*****l
发帖数: 97 | 39 共转带Puro／GFP的质粒，用单个Crispr的1:4甚至更少，然后筛选。 |
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m******o
发帖数: 8504 | 40 用PURO或者GFP筛选一下下，然后从剩下的里面的里面筛单克隆，效率还挺高的。不过
这都是建立在transfection效率还不错的基础上 |
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j******i
发帖数: 939 | 41 大概是stem cell reports档次吧 一个puro＋pcr就能找到double allele 高级点结合
piggybac去掉筛选标记 楼主的方法比较少用 大概很多人觉得不够方便吧 |
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h*****G
发帖数: 113 | 42 只要是mamalian codon optimized的Cas9就可以，最好带GFP or antibiotic
selection，这样可以sort transfected的细胞。
Cas9-2A-GFP/Puro-U6/H1-gRNA的最好。
对于knock-in cassette, 如果你只是single or a few nucleotide mutation, 那么
最方便的应该是直接order single stranded DNA, 长度 ～ 100 nt. Homology arms >
40 nt 就足够了。
如果是要knockin比较大的insert，比如说GFP reporter，那么可以需要克隆到质粒上,
homology arm > 500 bp，就可以了。可以有antibiotic selection，也可以不用，取
决于你的效率。 效率低的情况用antibiotic selection，之后还需要一个step，用cre
-loxp把antibiotic selection cassette给去掉，否则在很多情况下会影响你gene的表
达。
在两种情况都要... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 43 CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC
CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG
GTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
bGH PolyA signal
mammalian terminators (SV40, hGH, BGH, and rbGlob) include the sequence
motif AAUAAA which promotes both polyadenylation and termination. Out of
those listed, the SV40 late polyA and rbGlob polyA are thought to be more
efficient in terminating transcripti... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 44 从我拿到的单双replacement克隆的比例看，不如直接多筛克隆，就差一倍呢。倒是可
以在实验流程上多点手脚，提高机会--如果是细胞生长必需的基因，两个guide有必要
；puro筛选可以比我作的再很一点。另外，可以考虑genotyping的时候，不做单个克隆
，而是一次十个二十个的做，有阳性混在里面后，再把那一组拿出来，克隆，再
genotyping。
要是非必需基因，可以考虑HDR上加一个G418 筛选cassette，放在intron里面，用loxP
放两边，以后用cre切掉。就不知道剩余的一个loxP会不会对splicing有影响。
Knockout |
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发帖数: 1 | 45 最近我需要在human ESC里过表达gene of interest。我用的是pCDH vector，然后做
virus transduction，接着把细胞养在含有puro 的media里。开始还有不少colonies存
活，并且还是RFP positive（我用的pCDH是带RFP的）。养了大概3－4代后，colonies
的数量开始越来越少。我和朋友讨论，据说是因为transgene容易被silenced？总共有3
个independent lines都出现类似的情况。大家对这个怎么看？有什么好的建议吗？非
常感谢！ |
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l***y
发帖数: 638 | 46 promoter用EF1a别用CMV系列，lenti表达个RFP十代没问题。silencing没办法就是快点
慢点，gene有功能的影响细胞会丢得更快，隔几代用puro重筛一下
colonies
有3 |
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发帖数: 1 | 47 非常感谢。我用的pCDH是EF1a promoter，就是越往后传代，colonies数量越少。我把
细胞一直养在含puro的hESC media里。非常感谢你的帮助。 |
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发帖数: 1 | 48 非常感谢这么detailed的建议。我们系的一个PI给我建议了一个他自己改造的plasmid
，他说这个plasmid 包含 insulator，用的是Ubi promoter，同时带GFP-IRES-puro。
我先试试这个plasmid，看看能不能挺住不被silenced。非常感谢你的帮助，我自己没
有做过virus transduction，都是我们实验室的technician帮我做的。我把你的建议和
他讨论讨论，因为我觉得我们virus transduction的效率不是特别高。 |
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w*******y
发帖数: 60932 | 50 Searched but didn't see this offer
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