f******g
发帖数: 382 | 1 问题１
哪个refolding screening kit比较好， 产品太多， 看花了眼.
问题2
求推荐个96-well filtration plate 做96-well solubility test.
跪谢！ |
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s********n
发帖数: 2939 | 2 最近有个membrane protein得做refolding，大家有没有好的protocol和commercial
kits推荐？ |
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a******g
发帖数: 71 | 3 endostatin不是简单地一步Ni柱纯化，据我了解，应该是首先破菌，分离包涵体，充分
洗涤包涵体（洗涤过后纯度就达到90%），然后8M urea溶解，过Ni柱，然后有一步最关
键的refolding，也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
bond，在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后，50%以上的endostatin能
以可溶性单体存在，其他不能refold的则聚集形成胶体，经盐诱导沉淀后与refolding
成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%，银染无杂带。整个工艺应该还是非常
impressive的。
我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。 |
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v*****s
发帖数: 20290 | 4 The Paper Menagerie
by Ken Liu
One of my earliest memories starts with me sobbing. I refused to be soothed
no matter what Mom and Dad tried.
Dad gave up and left the bedroom, but Mom took me into the kitchen and sat
me down at the breakfast table.
“Kan, kan,” she said, as she pulled a sheet of wrapping paper from on top
of the fridge. For years, Mom carefully sliced open the wrappings around
Christmas gifts and saved them on top of the fridge in a thick stack. She
set the paper down, plain side ... 阅读全帖 |
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c****t
发帖数: 19049 | 5 One of my earliest memories starts with me sobbing. I refused to be soothed
no matter what Mom and Dad tried.
Dad gave up and left the bedroom, but Mom took me into the kitchen and sat
me down at the breakfast table.
“Kan, kan,” she said, as she pulled a sheet of wrapping paper from on top
of the fridge. For years, Mom carefully sliced open the wrappings around
Christmas gifts and saved them on top of the fridge in a thick stack.
She set the paper down, plain side facing up, and began to fold it... 阅读全帖 |
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r****o
发帖数: 105 | 6 Do you have a way to distinguish correctly folded protein? If you have,
just use HPLC to purify them from crude E.Coli expressed protein.
If you don't have one way to do that.
Refolding involves (1) denaturing and reducing (2) suddently dilute
the sample extensively to mild condition (3) get the soluble protein.
Try to search pubmed for methods or refer to any classic protein biochemistry
protocol book. Note: the yield is low(less than 10% of the crude protein
will be correctly refolded). |
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发帖数: 1 | 7 一个加州理工毕业的说（引用他的话，是用来驳斥的。在没有RaTG13之前，他说的其实
有理。）
“
I performed BLASTn and Clustal alignment on the Wuhan coronavirus and cross-
annotated missing CDS regions. I found that Bat SARS-like CoVZXC21 and Bat
SARS-like CoVZC45 are the most similar coronaviruses. The sequences are
different at quite a few silent point mutations but sufficiently close (95-
93%) to indicate a lineage that has not diverged significantly- this is a
recent strain with a close common ancestor. Some regions don’t even have
sile... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 8 Puma2019 发于 2020-01-29 08:58, 论坛:
标 题: 跟一个朋友聊了会，这次武汉病毒不像合成的。
quote 如下：
I performed BLASTn and Clustal alignment on the Wuhan coronavirus and cross-
annotated missing CDS regions. I found that Bat SARS-like CoVZXC21 and Bat
SARS-like CoVZC45 are the most similar coronaviruses. The sequences are
different at quite a few silent point mutations but sufficiently close (95-
93%) to indicate a lineage that has not diverged significantly- this is a
recent strain with a close common ancestor. Some region... 阅读全帖 |
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a******e
发帖数: 271 | 9 我google了一下
Dining Etiquette Guide
http://whatscookingamerica.net/Menu/DiningEtiquetteGuide.htm
How to use napkins:
In a restaurant:
As soon as you are seated, remove the napkin from your place setting, unfold
it, and put it in your lap. Do not shake it open. At some very formal
restaurants, the waiter may do this for the diners, but it is not
inappropriate to place your own napkin in your lap, even when this is the
case.
The napkin rests on the lap till the end of the meal. Don't clean the
cutle... 阅读全帖 |
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H********g
发帖数: 43926 | 10 从肽链合成的角度看的确是这样。
不过对于小蛋白质，有折叠成正确的3级构象的问题，催产素基本不需要考虑这个问题
。对于胰岛素而言还有两个链间二硫键的正确形成的问题。这个在体外重新构建复杂二
硫键的问题到现在也不是完全解决了，主要的方法还是跟几十年前一样，碰运气。在生
物体里专门有几套机制管这个事。
在60年代，还没有那个蛋白质自己折叠的实验(1973 Anfinsen)，像现在很常规的
refold之类的技术应该还没有设计出来或者广为人知。当时他们做出来胰岛素之后，还
专门做了结晶实验来证明合成的胰岛素跟天然的胰岛素完全一样。这个还是有点水平的
（也可能是运气好，胰岛素就是倾向于自折叠）。
当然从方法学上说，的确没有什么突破性的贡献（尽管很多诺奖得主也是一样）。跟那
个固相合成的人比，的确是别人更应该得奖。
peptide |
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z***i
发帖数: 8285 | 11 灌这么长。。
从肽链合成的角度看的确是这样。
不过对于小蛋白质，有折叠成正确的3级构象的问题，催产素基本不需要考虑这个问题
。对于胰岛素而言还有两个链间二硫键的正确形成的问题。这个在体外重新构建复杂二
硫键的问题到现在也不是完全解决了，主要的方法还是跟几十年前一样，碰运气。在生
物体里专门有几套机制管这个事。
在60年代，还没有那个蛋白质自己折叠的实验(1973 Anfinsen)，像现在很常规的
refold之类的技术应该还没有设计出来或者广为人知。当时他们做出来胰岛素之后，还
专门做了结晶实验来证明合成的胰岛素跟天然的胰岛素完全一样。这个还是有点水平的
（也可能是运气好，胰岛素就是倾向于自折叠）。
当然从方法学上说，的确没有什么突破性的贡献（尽管很多诺奖得主也是一样）。跟那
个固相合成的人比，的确是别人更应该得奖。
peptide |
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w**********u
发帖数: 132 | 12 Physical and human geography
The land
Relief
About 95 percent of Fukien is mountainous. The province is crossed by several
ranges of moderate elevation that run roughly parallel to the coast. They
constitute a part of a system of ancient blocks of mountains trending from
southwest tonortheast. The Fukien–Chekiang section forms a part of a raised
massif that has been subjected to folding and refolding. A sharp natural
boundary exists to the west and northwest between this uplifted block, on the
o |
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s***e
发帖数: 911 | 13 好像是的. 调控细胞运动的机制很复杂. 分子水平上参与的分子非常多. 其中一个是
Talin-Vinculin interaction. 一个猜想的机制认为细胞前沿extension-retraction会
导致Talin unfolding-refolding. Unfolding会导致Vinculin binding. 这个coupling
被认为是个细胞mechano sensing的机制. 最近Michael Sheetz组里一个工作就在单分子
水平上直接验证了这个猜想.
Science 30 January 2009:
Vol. 323. no. 5914, pp. 638 - 641
DOI: 10.1126/science.1162912
Prev | Table of Contents | Next
Reports
Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding
Armando del Rio,1 Raul Perez-Jimenez,1 Ruchuan Liu,2 Per |
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g*****3
发帖数: 107 | 14 最近在提纯一个GST-tag的蛋白，蛋白表达在pellet需要denature condition提纯， 纯
化后需要做活性检测。怎样才能让蛋白的活性在提纯过程中不丢失呢，需要用
refolding kit吗？谢谢 |
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a***e
发帖数: 1010 | 15 yeah, you need refolding most of time.
An alternative method is adding some sarkosyl during purification, which
solublizes your protein into the supernatant. |
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m**i
发帖数: 47 | 16 我看了NEB家的elution的条件是75C的Tris-HCl （pH 7.5)，也许streptavidin
denature了等凉了之后还能在refold? pierce家的让用Guanidine-HCl,肯定就没法
recycle了。 |
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m********r
发帖数: 124 | 19 1.你说的很对，但我们想用NMR去identify另一个蛋白的binding site,便于以后设计
mutant;
2.buffer里面是250mM,应该不低吧
3.如果本身是个没有高级结构的话，refolding似乎问题也不少吧，怎么知道变回天然
的了？
4.GB1也是不大的tag,理论上应该也能帮助后面的折叠吧。。。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 "2.buffer里面是250mM,应该不低吧"
——250 mM还好啦
试试看500 mM
给你看个我的某个his蛋白纯化的比较
另外我说GST tag帮助你这个没什么二级结构的蛋白折叠不是说GST tag小
我反而觉得大一点的tag可能更有帮助
refold能不能回到native？这个问题不好回答。所以一般而言denature条件纯化是最后
一个选择 |
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s********n
发帖数: 2939 | 21 你表达的蛋白有酶活性么，有的话测一下上清，没有的话只能做WB。如果确定上清里有
你的蛋白，而且你需要的量不大，你可以试试直接从上清纯化。如果要的量较大，可能
就需要摸条件了，比如温度，IPTG浓度，strain等，实在不行再试试refolding from
inclusion body. |
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J********n
发帖数: 534 | 22 版上有用这个cytokine的人么？
最近需要>1 mg的蛋白，做一些binding study。查了查，1个mg都要5000+。
有人能推荐推荐质量过关，价格又比较便宜的vendor么？
E.coli refolded or insect cell expressed的都可以。 |
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J********n
发帖数: 534 | 23 $5000 for 1mg?
Too expensive.
Do you have the E.coli expression plasmid?
May I get some from you? I have the refolding protocol.
vitro.
rich. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 谁说ion exchange必须要denature的？！
你们组里面很奇怪啊
一般而言denature然后refolding是下下策
是没有办法时候的办法啊
怎么还有人把不是包涵体的，可溶的蛋白特别变了性纯化呢？
不太明白 |
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g*****p
发帖数: 451 | 25 没见过这么说话的，这根本也不是严谨的科研态度
人家用了tag纯化也好，refolding也好，只要达到对应的功能指标
有啥不可信的？
结构有没有变化又不是凭空乱猜的
况且绝大多数用tag帮助解析了结构的蛋白和untagged的蛋白结构的比较显示
也没见有啥大的差异 |
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l*********s
发帖数: 5409 | 26 I don't believe you can get natural configuration by refolding. |
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n***w
发帖数: 2405 | 27 谢谢了。。。
再问个问题，我如果变性提蛋白，是不是refold以后才能再bind to beads？ |
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e****s
发帖数: 1125 | 28 从来没做过，不敢乱回答。
觉得His应该没问题，GST-tag估计得要Refold? 毕竟是酶和底物。 |
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s***m
发帖数: 6197 | 29 Kinetics of DNA Refolding from Longitudinal Exchange NMR Spectroscopy
Romana Spitzer, Dr. Karin Kloiber, Dr. Martin Tollinger, Dr. Christoph
Kreutz
Article first published online: 7 JUL 2011
DOI: 10.1002/cbic.201100318
Link:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cbic.201100318/abstr
Transition State of Rare Event Base Pair Opening Probed by Threading into
Looped DNA
Maxim Kogan1, Prof. Bengt Nordén1, Prof. Per Lincoln1, Dr. Pär
Nordell2
Article first published online: 7 JUL 2011
DOI: 1... 阅读全帖 |
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u*******r
发帖数: 27 | 30 药用蛋白在纯度之外还要要考虑几个重要的问题：
1.immunogenicity
这也就是要切去his的原因，虽然his的免疫原性不高，但是还是有的。这所产生的
immunogenicty不仅使其可能对人体有害，还会complicate the whole efficacy
studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it
compromise the eeficacy?
2. 提存和处理过程中的杂质。
其中包括内毒素，各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。
其工艺据你的描述也没有什么了不起的。
refolding |
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a******g
发帖数: 71 | 31 endostatin的refolding是一件极其困难的事情，Folkman最早的paper里他们提到有99%
的蛋白沉淀而无法复性，所以罗的工艺在此处有独到之处。
罗的工艺基本是遵循纯化，复性，再纯化（不依赖Ni柱）的途径，最后产品纯度高当然
不只是蛋白质，并且元素检验也没有Ni残留，至于你说的endotoxin更是检测不出。
如果你不了解具体的过程，就不要着急trivialize别人的东西。 |
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l******g
发帖数: 1623 | 32 感谢各位的讨论, 挺有启发, 特别是思你特提的第二点,从酶动力学上动脑筋. 我早就
该找本酶学书来看了,以前学的都忘记了.
这蛋白我已经作的很纯了, load 5 微克,跑SDS-PAGE, 只有这蛋白和它切了的fragment
. cleavage site也map出来了, 作的N-term AA sequencing. 突变cleavage site不怎
么影响cleavage, 但突变离开这site几个AA的地方,有不被cleave的.
在E.coli里面表达出来是包含体里面, 纯化很简单, refolding后也会有cleavage, pH8
.5 比较抗降解. 最近作RP HPLC, load上柱前有90%左右intact, 下来后>90%都被降解
了. RP HPLC的buffer pH 4. 有没有什么protease是在酸性下活性高的? |
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a*****h
发帖数: 67 | 33 先谢谢您的回复~
不是变性条件测的，是refold之后的条件下测的，蛋白里面除了2个Trp外（我给突变成
Phe了）还有4个Tyr残基，Tyr对290激发的Fluo光谱背景影响很大么？请问您知道从哪
里能找到关于这些氨基酸intrinsic fluo的信息啊，谢谢啦！ |
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x*****o
发帖数: 441 | 34 一种蛋白, 提纯之后refold然后保存在-80, 之前那个人保存的体积很大, 所以已经解冻4次了. 我现在要用这个样品.
反复多次解冻会造成什么问题,是降解还是denature, 还是两者都有? |
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i**y
发帖数: 71 | 35 Many enzymes lose activity upon heat and cannot refold without chaperones.
Lysozyme, alcohol dehydrogenase are among some of the commonly used models.
I measured heat inactivation of trehalase when I was in college, also very
easy. |
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k****l
发帖数: 279 | 36 我用过 AthenaES Quickfold
他们有多种不同的buffer，可以迅速试试哪个好 |
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b******n
发帖数: 4225 | 37 对付molecular chaperone的一个好方法是加Mg-ATP
具体就是Precission protease digestion之前柱子先用含5mM ATP和5mM Mg2+以及10%
的glycerol的wash solution（其他盐的浓度不变）洗几个bed volume，incubate半小
时，然后就可以elute下来检测纯度，如果杂带大幅缩减了，就说明条件摸对了,以后依
法操作之后再in column digestion
至于切掉GST不稳定这个就没啥太多办法，过度表达的蛋白很多都是folding不好的
hydrophobic patch暴露很多要么aggregate，要不招来molecular chaperone
除非你费力去refolding，或者摸表达条件 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 38 不是的，这些东西，难度不大。
难在营销，建立很庞大的市场知名度和销售渠道。否则真不够养活开始那些人的。
mouse gene KO 是个手艺活，单个项目收费可以很高。
高质量的生长因子，1mg 4300 usd，真要掌握技术程序，摇个2000ml LB E.coli. ，
lysis，refolding if necessary， FPLC and/or HPLC，简简单单就出来了。但光靠这
个是无法生存的，
哪里有顾客？ 人家凭什么买你的？ 人家愿意多少钱买？ 有谁1mg 的买？ |
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s***k
发帖数: 29 | 39 自己想要表达一个蛋白，里面有几个disulfide bonds。文献中使用DsbC来完成
refolding process。在网上查了下，这种enzyme价格很贵。有没有其他disulfide
isomerase可以用来作为它的替代物？自己目前几乎没有生物背景，希望版上诸位前辈
能多多指教。 |
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b*****y
发帖数: 175 | 40 My protein was eluted in 0.3% vitamin C in H2O and lyophilized (vitamin C
was intended to prevent any Met oxidation of my protein). Since I know
highly acidic pH is not good for LC-MS so I tried three different approaches:
1. directly dissolve in ammonium bicarbonate and adjust pH to 8
2. directly dissolve in ammonium bicarbonate and dialyzed against ammonium
bicarbonate (3 changes in 6 hrs) and the final pH is 8
3. dissolve in ammonium bicarbonate and buffer exchanged to 3M guanidinium
hydrochl... 阅读全帖 |
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E***n
发帖数: 308 | 41 Prep-RPLC?
not popular in industry, are you going to refold it? |
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m*****n
发帖数: 3575 | 42 If I were player one, I will fold if my own number is greater than 0.5,
since the number of the opponent has less than 50% chance to outnumber mine.
If the first had fold, the second player knew the other number is greater
than 0.5, so the distribution narrows to (0.5,1], and will refold if the
second number is greater than 0.75, otherwise not.
if had not, the second player folds if his/her number is greater than 0.25. |
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