h********n
发帖数: 4079 | 1 I use miRNeasy from qiagen.
Please notice that RNeasy will not yield miRNA or other small RNA. |
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m**z
发帖数: 787 | 2 我们实验室的DNA相关的都换成fermentas的了，work得很好啊，据说便宜不少，里面的
东西其实是一样的，连buffer都可以通用。。。RNA的kit不知道怎么样 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 3 我们的内切酶都换成他家的了，趁着上一波买一赠一的时候换的，用着也不错。和他们
的客服交流说，他们的很多DNA，RNA kit目标是冲着Qiagen去的。希望能做出和Qiagen
一样质量但便宜很多的kit。
估计他们没有两把刷子也不会被Thermo-Fisher收购。 |
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w******a
发帖数: 1527 | 4 借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？ |
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w******a
发帖数: 1527 | 5 I don't think it is good, coz it takes me 2 hours to get the RNA... |
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e*****t
发帖数: 642 | 6 这个。。。
RNA seq，你送样品去测序不就行了，也不用你自己做。
重要的是随后的bioinfo，一般用bowtie做seq alignment分析。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 7 Could you please elaborate on it? thanks,
my research online and on the phone produces that most of the services ask
for 40-50k/sample if we just handle over the sample(total RNA or ChIP-DNA),
and they do the rest...or anywhere between 900-1500 per lane if they only
handle the sequencing part... |
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n********k
发帖数: 2818 | 8 Thanks, Any tricks on constructing the library or any step along the line. I
have heard that contamination could be a huge problem, and trace of ethanol
is very bad etc etc...
Also, are there good software packages for data analysis and annotation,
such as strand specific analysis, long-non-coding RNA etc etc... |
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c*********r
发帖数: 1312 | 9 我做了四个RNA-seq样品，前两个是mRNA-seq，后两个是自己用invitrogen的Ribo-
Minus除去rRNA，期望能得到long ncRNA。样品是学校的Genomic core facility制备的
，一个大概$400多，测序和分析是在collaborator那里做的，目前没要钱，所以还不知
道他家的价钱。
但学校Genomic core facility的报价是：2x75 GA v5 kits：$2060/lane.
去年七月份在new mexico的一个institute做了一个咨询，价格大概是这样的：
Given:
- 2 libraries (you have already used the illumina SIPE kit to make paired
end library)
- Request for mRNA sequencing (PE)
- Sea urchin. genome size is ~850Mbases http://www.scienceonline.org/cgi/content/full/314/5801/941 so... 阅读全帖 |
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E****A
发帖数: 184 | 10 没用过promega，但用过qiagen和invitrogen的，发现qiagen的kit提出来的rna都特别
漂亮 |
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s****z
发帖数: 50 | 11 准备用real-time PCR 检侧一个RNA在细胞核和细胞质中的分布。
请教板上的大虾，用什么做internal control 比较合适啊？
似乎18S, tubulin, etc, 都不好 |
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m**********2
发帖数: 57 | 12 想分析比较两个样本之间的某个信号通路中的所有基因和一些target基因的表达状况。
有谁知道哪家公司提供这种specific signaling pathway的 RNA array? 最好是基于
hybridization的而不是RT-PCR,因为没有RTPCR仪，要去借比较麻烦。谢谢提供帮助。 |
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s******n
发帖数: 47 | 13 准备做RNA-seq，一些protocol上提到 illumina barcoded adapter，
请问，这个barcoded adapter 跟 non-barcoded adapter 有什么区别？
不甚感激！！！ |
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z***q
发帖数: 907 | 14 一个小的hairpin loop(27nt),用核磁做其结构。在水中看base pair(imino-imino,
imino-amino),folding correctly, connectivity也很多，但是5-8ppm的peaks are
totally
messed up, very broad and not well resolved.换到D2O中也是一样，即使2D
expperiemnts, 也不能很好的区分各个峰。1D上就像一个大的馒头峰，上面插着若干个
小叉子
（小尖峰）一样，无法分开各个峰。
像请问各位大侠，有人遇到过这种情况么？这个RNA 到底有没有正确折叠呢？从非变性
胶上只
看到一条清晰的条带，确定是monomer而不是dimer.如果结构不对的话，有什么方法可
以使其
正确折叠呢？我已经试过了加热快速冷却，缓慢冷却，改变盐离子浓度（50mM,100mM),
pH值
（试过4.5，6.0）都不管用，而且每次得到的谱图（1D）都不一样，都快被它搞崩溃了
。是不
是接下去只能考虑换序列了？老板也完全不能理解这种情况，只是反复和我强调我的操
作有错
误，他这么多... 阅读全帖 |
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x*****o
发帖数: 441 | 15 我觉得可能是有很多dynamics, 结构不稳定. 你看到到的有可能有好几个comformation
的混合物. RNA的结构很多变,dynamics是特点.
看看能不能再多加点一价金属,稳定一下结构.其实稳定结构镁离子最好,但是听说NMR不
能用镁. |
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z***q
发帖数: 907 | 16 恩，你说的很有道理
感觉RNA的结构基本上由序列决定了，序列不行，怎么做都不行。。
再次感谢你的回复，给你发个包子吧 |
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s******s
发帖数: 13035 | 17 Trizol肯定work, 那个kit没用过，估计也不会有问题，
抽RNA属于比较简单的活。
那个RNAlater据说很牛，没用过。Seq结果啥叫有多可信？
bias肯定有，基本和realtime一致
seqencing。 |
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e*****t
发帖数: 642 | 18 rna seq比array可靠性要高很多，前提是reads的数量比较大。
而且如果你能做bioinfo的话，有很多数据可以挖。 |
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F*****e
发帖数: 182 | 19 大家是提取total RNA后就交给facility做后面的呢？还是自己做library？我们的
sample可能比较多，老板希望自己做library。 |
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e*****t
发帖数: 642 | 20 give your whole RNA extraction to seq facility for library preparation. it's
tedious to do it by yourself.if you have time, spend more time on
downstream bioinfo. that would earn you more no matter in publication or job
hunting in the future. |
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D*a
发帖数: 6830 | 21 晕，这个genotype不是普通的mutant还是wt的genotype么？
我以为是lz要看看mutant是不是影响某些rna，可能我理解错了吧 |
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F*****e
发帖数: 182 | 22 genotype最快也得2-3个小时吧，把胚胎的尾巴拿来用NaOH煮一下，Tris-HCl中和以后
离心取上清
直接做PCR，PCR run一个半小时，跑胶20min。
今天听说Ambion也有一个RNAlater solution，把tissue放在里面很稳定，据说很牛。
我们就是想看看mutant里面哪些基因的RNA水平有变化，然后跟phenotype联系起来好找
mechanism
啊。
做library的话facility用的是illumina mRNA sequencing sample preparation kit，
两天完成library，似乎不用花太大力气。有没有做过的朋友？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 23 一端是2'F RNA，另一端是DNA，splint template是DNA，这样DNA ligase会
work吗？呵呵 |
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w*****n
发帖数: 107 | 24 the traditional T4 RNA ligase has very low ligation efficiency. While T4 DNA
ligase is very robust. |
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U*O
发帖数: 99 | 25 不知道sequence所以不能用qpcr
请教一下用什么办法测少于10ng/ul的微量RNA(length, sequence unknown)比较好？
实验室里有人推荐bioanalyzer，但是怎么知道不是DNA contamination呢？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 我记得好像有一种机器叫做nanodrop 可以测微量的RNA |
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l******u
发帖数: 936 | 27 Agilent bioanalyzer所有分析RNA的kit我都用过，还好吧，
这个比做microarry简单多了。
不过如果不是一些omics的lab，一般不会买这个东西。 |
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c*****g
发帖数: 66 | 28 I think what you need is a single strand RNA specific dye such as RiboGreen,
and read on a fluorometer. |
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e*r
发帖数: 103 | 30 有什么在线软件可以预测RNA序列的结构？比如 hairpin什么的 |
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y***y
发帖数: 563 | 31 这篇新发在science上的.谁能搞到啊?
Widespread RNA and DNA Sequence Differences in the Human Transcriptome
很想拜读啊!! |
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f****n
发帖数: 114 | 32 小弟最近在做RNA in vitro transcription，用的是ambion 的MEGAscript kit。
可是不论是用PCR产物直接做模板，还是连接到质粒上再线性化做模板，都得不到sharp
的条带，size比预期小很多并且有拖尾，但kit里阳性对照可以出来。
已经排除了RNase污染。估计是DNA模板纯度的问题，请问各位PCR产物用啥方法纯化？
另外，我在T7promoter序列前面加了7个碱基，难道是这个影响酶的效率？
请各位高手帮忙！ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 33 如果只是差不多看看的话，DNA marker分子量乘以二咯
DNA marker是ds
RNA是ss
脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的单个分子量有差别但是跑琼脂糖电泳的话你这么粗略比
较一下没什么问
题 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 35 谢谢楼上各位，尤其是Chamgrape的方法，如果真的管用那太好了。我今天试了下一个
total RNA。一条亮带在0.8kb，一条暗带在1.4kb，乘以2之后勉强接近18S和28S的大小
了。粗略定量也许可以吧。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 36 要配一个200 mM MOPS buffer，做RNA的相关实验，如果我用DEPC-treated water来配
，在配好后还需要拿去autoclave吗？谢谢～ |
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s******n
发帖数: 63 | 37 鉴定老鼠需要提取尾巴的RNA，不知道该用什么kit提会纯度高一些？
烦请做过的朋友推荐一下好的试剂和方法，有什么注意事项，谢谢，bow~~ |
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s*******n
发帖数: 37 | 38 最近做了一个small rna library(~40-60 bp)，adaptor ligation, cDNA ，ＰＣＲ，
gel purification 做的都没问题，在送去大规模测序前想做个Topo-TA cloning, 先挑
几个克隆测测，做了两次都没什么真的克隆，也就十几个，不知道板上有没有人有这方
面的经验。谢谢。 |
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c********b
发帖数: 363 | 39 在一种protist中平时genome是分裂成小片段的，在细胞分裂的时候出现small RNA协助
重新组装出完整的genome。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 40 请问诸位，RNA-SEQ结果该用什么软件分析，五千万个reads左右，需要什么样的运行平
台和硬件配置？ 我是做bench的，粗通bioinfo，NGS刚刚开始接触，请各位多指点。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 41 想对in vitro RNA transcript做end labeling，最好是labeling by
synthesis，一步到位。除了biotin之外还有没有其他off-the-shelf
的modified NTP可以做labeling？如果label after synthesis，
除了biotinylation或radio labeling，还有什么commercial kit好用？
多谢！！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 42 is it digoxin dNTP analog which can be incorporated into xcript?
or digoxin NHS ester which requires a NH2 modified RNA and
additional conjugation step? The latter is common but can be trouble
Thanks! |
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s******s
发帖数: 13035 | 43 用RNA probe Fish fixed的细胞的，不是DNA probe的 |
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m***o
发帖数: 272 | 44 加TRIreagent时，发现分化的细胞，因为lipid比较多，就离心了一下，然后发现离心
后，我做的这个gene RT-PCR 比不离心要多出来很多。但是这个离心对没分化的细胞变
化就不大。这样我比较分化和没分化时的gene 表达就会因为这个离心而不同。
离心后，分化的细胞有些pellet，估计是没有裂解的细胞核。这样离心后cytosol的RNA
就会多很多。但是没分化的细胞因为细胞量少，所以裂解的充分些。
请问该怎么做才能最客观检测变化呢？ |
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y****u
发帖数: 74 | 45 48 hours? a little bit too long....
If I were you:
1. tissue samples, use RNA later
2. cells, lysate them and store in -80. |
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z*t
发帖数: 863 | 46 RNA怎么沉淀？异丙醇沉淀可能会造成盐浓度过高，可以换2倍体积乙醇
230高是混了酚类和盐。理论上70%乙醇洗可以降低盐类污染 |
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b*******0
发帖数: 125 | 47 有没有做RNA-sequencing的大拿？科普一下呗。
不太明白，为啥测序还能知道基因表达差异呢？ |
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h****k
发帖数: 182 | 48 使用的是tissue, 书上写的是不要超过30mg, 30mg看起来是个3mm的小方块。过量使用
tissue后效果会怎样？另外加了RLT buffer之后RNase还会降解RNA吗？ 书上写的是RLT
buffer含有guanidine thiocyanate. |
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c********b
发帖数: 363 | 49 it will reduce the quality and yield of RNA. For beginner, never try to be
greedy. More is not always good. |
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c******d
发帖数: 306 | 50 还是要用专门的non-coding RNA seq？ |
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