r****o
发帖数: 105 | 1 I have similar experiences as yours. That is about determination
the anomericity of glycosylation on EGF repeats. It involves
processing the small domain EGF into peptides, and then subject them
to glucosidase digestion.
I would suggest you using HPLC with either Reverse Phase or Gel filtration
column(like superdex from Pharamacia). This is the best way to recover
small amount of peptides. If your sample has quite a lot and the MW is
big enough, you can try acetone precitation to get rid of |
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 可以先跑个small scale的看看。我刚才说错了，用sephadex估计分不了，你的样品估
计要用Superdex 200来分，我没跑过DNA的制备柱，但是理论上应该比蛋白难不了多少
吧。 |
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m**i
发帖数: 47 | 5 多谢。superdex 200看起来好像能work。到时候不行就试试这个。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 Superdex 200应该可以用来分离这个蛋白和它的aggregate。但是你光有柱子不够啊，
还得有FPLC系统，你还得会用FPLC。
收集蛋白峰不是看颜色的，是看它的紫外吸收。这么大的蛋白肯定有280nm的吸收峰的
，所以不用担心错过它。 |
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a****k
发帖数: 1130 | 7 你不是有抗体的吗，gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
方面的实验，是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
position出来的，monomer和tetramer肯定是可以分开的 |
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b******y
发帖数: 627 | 8 The C-terminus question was answered by onfire.
You are right that reducing agent is prohibited during reaction. However,
DTT or BME can be used to quench the reaction. The manufacture should have a
better protocol. However, neutral pH and room temperature should work. I
will do a small scale reaction, take a few time point, and run SDS-PAGE to
see when the reaction close to finish.
You can purify it using superdex peptide column from GE if needed. Otherwise
, just dialysis into pbs and inject. |
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a****k
发帖数: 1130 | 9 完全没看懂。。。
你是要纯化某一个蛋白？什么叫不稳定，容易被降解？什么叫总聚集在一起。。每个
fraction都跑胶了吗？蛋白多大，特性，用的superose 6还是superdex 200还是什么？ |
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m*******8
发帖数: 256 | 10 最近用昆虫细胞分泌表达了两个蛋白的复合物，his tag纯化以后用Amicon浓缩体积到
300ul左右上Superdex 200柱子，结果只有很低的峰。跑了PAGE胶，gel filtration之
前取了1/150体积的样，蛋白量很多，过柱子后的fraction取了1/20的样，基本看不到
条带。把所有的fraction收集起来再用Amicon浓缩，也没蛋白，不知道蛋白哪里去了？
过柱子时奇怪的是基线一开始就从0 mAU跳到30 mAU，目的蛋白处的峰只有45mAU,在一
个柱体积快结束的时候突然出现很多500mAU左右的峰，不知道是什么东西。辛辛苦苦搞
了这么多蛋白全没了，很沮丧，关键是不知道哪里出错了，哪位大侠能指点迷津，不胜
感激！ |
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m*********r
发帖数: 49 | 11 我正在做2个蛋白的纯化（分别纯化），一个约270kda，另一个约90kda。以前一直
在用GE prepacked Superdex 200（bed volumn=2.4ml, loading volumn=50ul) 的一个
小柱子做微量的size exclusion纯化然后用来做生化试验。
最近对所需蛋白量要求变大了，所以正在找合适的大柱子能让我一次的loading
volume到~5ml. 碰巧前几天旧的UV detector的灯泡也坏了，问别人说换新的要700多刀
，还不能保证修好。现在我盘算着能不能干脆整套新的。
我问了下周围的同事，有人给我推荐GE的AKTA pure系统。我看了下觉得功能太多
太花哨（估计也很贵），对我这种只需要单一步骤蛋白纯化的人好像太浪费了。所以上
来问问有没有用过或者熟悉这方面工作的朋友，给我推荐下经济又简单实用的一套
chromotography系统。
顺便问下，如果我买单个组件自己DIY一套能省些钱么？比如pump, column,
detector, computer+software找不同公司买能兼容的... 阅读全帖 |
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f******n
发帖数: 1 | 12 gel filtration(GF)柱子最常用的就是GE的了. 一定要5ml的话必须是Hiload column.
16/60 的最大能上5ml.但是看你用的应该是Superdex 200 GL 5/150. 这个柱子分辨率
比hiload高.你的样品未必在Hiload上也能分开. GL的柱子有 10/300的,24ml bed
volume.能上样0.5ml. 如果溶解度不是问题,浓缩10倍上这个柱子好了. 另外,你真是就
只过一个GF柱子没有其他比如affinity column? 蛮奇怪的.
GF的柱子都是要HPLC级别的pump才能带得动的. 这样的系统不可能便宜的. 要省钱就放
弃那些自动功能,诸如多个inlet,outlet还有多柱切换什么的.AKTA的purifier可能便宜
一点.
DIY就算了吧.这些公司的系统设计都是不考虑兼容其他公司部件的.自己组合太折腾了. |
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