发帖数: 1 | 1 SYBR是啥毒？我还没接触啊。。。
为了安全起见，看来以后在公共场合都要喝密封的饮料了。。。 |
|
发帖数: 1 | 2 为了证明我容易吗我
另外其实应该把probe去掉做sybr 减少因序列差异导致的漏网可能性 |
|
v*******n
发帖数: 8995 | 3 你丫有文盲了
只要有引物序列 公司合成要多少有多少
用sybr连接头都不要
★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.5 |
|
T****i
发帖数: 15191 | 4 它们的RT-PCR是Taqman 还是普通的Sybr Green? |
|
发帖数: 1 | 5 taqman也得需要引物，而且比sybr green 还要多一个探针序列 |
|
z*******o
发帖数: 4773 | 6 ICH
IDT
LCUT
MDF
NOIZ
NTSC
RCMT
SYBR
THMD
TRS
UHAL
WSCI
WSTL |
|
f*****a
发帖数: 7 | 7 I only use SYBR. What I did is
1. Use Primer Express 1.5 or 2.0 from ABI to design primers. Follow their
guidelines. Or just use Primer3.
2. Use Amply 1.2 (or higher) and Netprimer http://www.premierbiosoft.com/n
etprimer/) to evaluate candidates.
3. Blast your primers.
4. Pick up 2-3 pairs. Do standard and dissociation curves. Chose the one wor
k best.
Make sure to chose the right normalization primers for your experiment. 18S,
actin, GAPDH, tubulin... |
|
t*x
发帖数: 1065 | 8 半年前用相同的primer,cDNA synthesis kit做的，当时cDNA只用到了0.1ug/reaction.
半年之后其他东西几乎是相同的，只不过RNA是新提的（但用的相同的kit),还有SYBR
Green Master Mix是新买的，但发现，cDNA已经用到了很高的浓度(2ug/reaction)，但
Ct值还是比以前的Ct值晚出现好几个cycle,请问会是什么原因呢？
RNA quality已经跑胶检测过了，是完整的。
会是Master Mix的问题么？是新买的啊，一直保存在-20C.
多谢大家指教！ |
|
v*******a
发帖数: 759 | 9 run 10ul in agarose gel, stain with sybr green gold, compare to standard |
|
h********n
发帖数: 4079 | 10 SYBR safe挺好的啊, 我用了好几年了. |
|
j*******8
发帖数: 94 | 11 ding, I used SYBR safe too! |
|
k*********2
发帖数: 4 | 12 是啊，我们实验室就用的SYBR safe，具体牌子没注意
非常方便啊，就是有些贵，好像一盒胶就十几二十个要快100欧元，明天去实验室看看
牌子和价格。
有一个小机器相当于电泳槽，胶是预制的一块块塑料板，各种浓度都有。
每次用的时候打开包装，把塑料胶板卡在小机器的槽上（不加buffer），去掉梳子直接
加DNA样品（不用加蓝），就可以跑了。跑的时候可以用它的uv背光直接看，跑得差不
多会自动终止（没有跑丢的危险，我喜欢）。拿板子直接照相，不会有水滴的到处都是
~~~~
最方便的是如果要回收DNA时不用胶回收试剂盒。有一种有两排上样孔的胶版，上面加
样下面加水，DNA快跑到下面那个孔时，用背光看着，当DNA跑进去的时候吸出来，真的
超方便，不小心跑过的话还能往反方向跑，哈哈
我们实验室是这个系统和传统的胶都用，这个虽然贵很多，但如果大家经常要胶回收的
话，用这个就省了回收试剂盒了。 |
|
s********n
发帖数: 2939 | 13 现在全部都改用SYBR Green和GelRed了，下游的操作和用EB一样，唯一的优点就是切胶
的可以不用紫外，既保护自己也保护DNA，但我都是严格按照EB的防护处理的，毕竟能
够和DNA结合的dyes，估计突变毒性不会小。 |
|
A********0
发帖数: 3310 | 14 我们组的也是推广用sybr safe.
就不明白国内来的博士就是怎么都不改,一定要用eb. 真是让人头痛. 搞得组里其他人
很有微辞. |
|
E*******2
发帖数: 131 | 15 我正在做ChIP-qPCR， anti acetyl Histone H3 and H4, 将来也会考虑做anti
methylation histones，现在遇到的问题
是，找不到合适的control gene primers. Millipore 公司提供的chip kits里用的
GAPDH。 但是我们领域有几篇文章是用
的beta globin和beta tubulin。我的老板说用我们领域已发表的。然后我查了一下他
们用的primer sequences，有意思的
是他们用的是小鼠，但是primer sequences和大鼠的基因是完全匹配的，而和小鼠有1
－2个碱基不匹配。并且beta
globin的primer在大鼠基因中扩增的是hemoglobin epsilone2，而在小鼠中最可能扩增
的是hemoglobin y， beta－like
embryonic chain。 我的问题是，如果我选择beta globin做为我的control gene，我
是否应该重新设计primer，还是说
我可以直接用人家发表的primer sequence？但是他们用的是sybr |
|
E*******2
发帖数: 131 | 16 为什么不行呢？我的之前的目标基因也是用人家用sybr green的primers啊，自己再找
出primer所在的序列设计一个
probe就很好用了啊。
There
primer
these |
|
e******x
发帖数: 9 | 17 看到这里有很多牛人都做过CHIP试验。 想请教一下大家：
（1）一般做完IP以后大家是怎么purify pulled-down chromatin DNA的？ 我看到网上
说可以
用PCR purification Kit 直接纯化，请问这里有人试过吗？
（2） 我最近才开始摸索条件，上一次实践结果，一个sonicated lysate sample 还可
以， 但另
外一个IgG control 有阳性。请问可能什么地方出现问题了呢？
（3）大家有什么好的protocol可以推荐一下啊？我只是需要做一个简单的Myc-tag的
CHIP. 抓下来
Chromatin DNA 看看几个结合位点再两个条件下有没有变化。最后的结果想用Real-
time做。上次
买了一个Active Motif 的CHIP Kit. 但发现最后的elute buffer 好像和我的SYBR Mix
不兼
容，严重影响PCR反应 （必须稀释20倍以上）。
望高人指点， 万分感谢！！！！ |
|
c****l
发帖数: 1086 | 18 why not. check out sybr green. make sure no non-specific band or primer
dimer which will interfere with your Q-PCR readout. Usually the Q-PCR
machine will do a dissociation curve. |
|
f**d
发帖数: 1952 | 19 是q-PCR (SYBR Green)好还是Southern好?
如果是q-PCR的话,有没有用TaqMan的可能性? |
|
w******e
发帖数: 1187 | 20 gel star for DNA; SYBR gold for RNA |
|
|
c******r
发帖数: 3778 | 22 是，实际上target specific的primer可以run两三对都没问题。
qPCR为啥不能用multiple target specific primers？只要label不同颜色就可以啊？
SYBR当然是不行的，但是TaqMan是可以的哈 |
|
h***3
发帖数: 26 | 23 我的bench被安排在跑电泳的bench旁边，左手边就是那个扔胶的垃圾箱，实验室用的是
SYBR green，我查了查，也会irritate眼睛和上呼吸道，有经验的人来说说，这样的工
作环境会很不好么。。。 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 24 "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
测的基因"
这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
的。 |
|
|
j****x
发帖数: 1704 | 26 无论如何不建议使用1ul这样小的模板量，误差太大，我这里用机器人上样误差都有20-
30%，我猜想手工加之会更多吧
一般20ul的PCR体系，模板我使用4ul/以上（cDNA的话可以稀释），如果是sybr的话我
甚至用8ul，基本上模板造成的误差在10%以内了，再有triplicates基本上就消除影响了 |
|
Y*Z
发帖数: 1301 | 27 生物猛男们，请回答以下我的生物问题吧，谢谢
本人没有什么生物背景，小心的问一问：
1 用什么方法测定一个GENE的COPY NUMBER？怎么定量阿？
2 我想测得是MITOCHONDRIAL DNA 的 COPY NUMBER？和核内 DNA 的 COPY NUMBER
一样测吗？
3 要是提取的是 DNA 能不能用平时逆转录得到的 CDNA 后的 REAL TIME PCR 做啊？
我们实验室平时用 SYBRE MIX。 有没有人有PROTOCOL阿？还是只能用TAQ酶作阿？
问题有点入门化，也有点多。多谢各位指教阿。 |
|
Y*Z
发帖数: 1301 | 28 本人没有什么生物背景，小心的问一问：
1 用什么方法测定一个GENE的COPY NUMBER？怎么定量阿？
2 我想测得是MITOCHONDRIAL DNA 的 COPY NUMBER？和核内 DNA 的 COPY NUMBER
一样测吗？
3 要是提取的是 DNA 能不能用平时逆转录得到的 CDNA 后的 REAL TIME PCR 做啊？
我们实验室平时用 SYBRE MIX。 有没有人有PROTOCOL阿？还是只能用TAQ酶作阿？
问题有点入门化，也有点多。多谢各位指教阿。 |
|
X***n
发帖数: 366 | 29 Are you sure you used SYBR as probe? Have you set ROX as reference? |
|
m**********d
发帖数: 137 | 30 double check了，位置没load错
实验室的qPCR仪一直用来做taqman，很多年没人用过SYBR green了，我觉得可能是
detector坏掉了
还有别的啥可能么 |
|
y******n
发帖数: 8667 | 31 我们用SYBR很多年了，效果很好。直接加到胶里。 |
|
W*********n
发帖数: 775 | 32 今天要做个real time pcr,测基因表达的变化（处理组相对于对照组），因为好久不用
这个仪器了，所以有一步骤有点忘记了：
我是用SYBR 染色，所以不用探针。请问在新打开的file里面应该是分析法法选择应该
是：
Absolute Quantification 还是 下面的 那个相对定量方法(ccCt) ？
我记得以前用的就是Absolute Quantification ， 现在有点拿不准了。
谢谢啦 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 33 我用的试剂是Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master Mix，不过机器用的
是ABI 7500 |
|
f*********r
发帖数: 1233 | 34 根据我的经验，对照组总是显示最小的SD。代数方法和对数方法的偏差也小。无须多虑
。不过，治疗组就大不一样了。SD大过了一两个数量级。通常我们每个组的n也就5个，
远远小于n=30。虽然我们认为，代数方法与对数方法都符合正态分布，但平均值的计算
结果相差比较大。我个人主张还是用复杂公式解开所有指数来计算。
我同意你说的，尽量将所有样品放在同一个plate上跑。如果跑不下，按照以下方法处
理：
1）尽量在一张盘上只跑内参和一个靶基因，把其它的靶基因用另外的盘子跑，虽然这
样有点费sybr green。如果还跑不下，就
2）把triplicate改成duplicate。如果还跑不下，就
3）不要duplicate。如果一定要duplicate，就把duplicate1跑在plate1，把
duplicate2跑在plate2。总之，让一个盘子上容纳所有样品（最大数为48个样品，应该
够了）。
当然，如你所说，在每张相关的plate上都重复跑一套对照，是一个很好的参照。不过
这仅仅是个quality control，对计算relative fold change没有影响。
出来了大家一块做
... 阅读全帖 |
|
f*********r
发帖数: 1233 | 35 根据我的经验，对照组总是显示最小的SD。代数方法和对数方法的偏差也小。无须多虑
。不过，治疗组就大不一样了。SD大过了一两个数量级。通常我们每个组的n也就5个，
远远小于n=30。虽然我们认为，代数方法与对数方法都符合正态分布，但平均值的计算
结果相差比较大。我个人主张还是用复杂公式解开所有指数来计算。
我同意你说的，尽量将所有样品放在同一个plate上跑。如果跑不下，按照以下方法处
理：
1）尽量在一张盘上只跑内参和一个靶基因，把其它的靶基因用另外的盘子跑，虽然这
样有点费sybr green。如果还跑不下，就
2）把triplicate改成duplicate。如果还跑不下，就
3）不要duplicate。如果一定要duplicate，就把duplicate1跑在plate1，把
duplicate2跑在plate2。总之，让一个盘子上容纳所有样品（最大数为48个样品，应该
够了）。
当然，如你所说，在每张相关的plate上都重复跑一套对照，是一个很好的参照。不过
这仅仅是个quality control，对计算relative fold change没有影响。
出来了大家一块做
... 阅读全帖 |
|
D******y
发帖数: 723 | 36 I have heard it is good
substitute |
|
s********n
发帖数: 2939 | 37 Gel Red有毒性和变异性的检测，你可以看看，据说是减少细胞的通透性来降低毒性的
，不过我还是挺小心的，毕竟是结合DNA的。 |
|
|
|
c****r
发帖数: 199 | 40 用SYBR Green做了qPCR, 看dissociation curve的时候发现，虽然只有一个
peak, 但是当template的浓度变低时，这个peak所在的位置也跟着shift到低一
些的温度。大虾们给说说这是怎么回事情？
谢谢！ |
|
k****o
发帖数: 589 | 41 引物应该没问题。一是melting curve形状接近完美，没有小肩峰，融解温度也正常。
另外设计的时候考虑到了dimer的问题，已经加以避免了。blast的结果表明这些引物顶
多和genomic DNA有部分序列吻合，和其他基因的mRNA序列都不吻合。
所以我在想会不会是机器的问题。不过机器的基线倒是挺稳的。用的SYBR Green,噪声
产生的RFU变化不超过正负100。 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 42 简单的Sybr green的话你就比比看谁便宜好了
谁便宜买谁
不做realtime的时候还可以当个普通pcr用 |
|
x**e
发帖数: 163 | 43 用的是BIO-RAD的CFX-96 的机器，每个样品做3个技术重复，居然在3个技术重复里面Ct
值有2-3的差异。技术重复都是配成mixture然后pipet到3个well里面的，照理应该是绝
对一样的啊，分装的时候操作也很小心。
用的SYBR green是以前order的ROCHE公司的，在BIO-RAD的机器上做应该没有问题吧？
样品很珍贵，试了几次都快用光了，大家觉得有哪些可能原因？先谢了。 |
|
x**e
发帖数: 163 | 44 SYBR green都是在4°保存的，应该不存在均匀与否的问题。cDNA模板都是加的2ul，但
体系是10ul的。回头想一想，还真有可能是离心的问题。我大周末之前做的都还行。周
末由于我们系没有平板离心机，而有离心机的老美实验室又没有人来，所以就图了方便
没有离心了，但加样的时候还是注意了这个问题的，特异加到管底，减少残留在管壁的
可能性。
再试试离心后的结果吧。多谢各位 |
|
a******7
发帖数: 7936 | 45 我们Sybr Green都在-20C保存，15ul体系，6ul cDNA。加完封口混匀了离心一小会。一
步都不能少
封口要把膜来回用力按紧好几次，从中间向边缘绕圈按，先按边缘中间容易鼓起来。 |
|
l*****a
发帖数: 1431 | 46 RT. Can't type Chinese. Thanks! |
|
c**********e
发帖数: 230 | 47 功课没做够，打回去。
biorad网上，qPCR相关的介绍里就推荐的 |
|
z*t
发帖数: 863 | 48 目前在用real-time PCR扩一段基因组上GC rich region,设计了几条引物扩增不同的区
域，普通PCR跑胶没有见到可见的smear或者dimer。用ABI的SYBR green master mix
dissociation curve能见到多个peak，amplication curve也很奇怪。跑胶可以看到
smear和dimer...最简单的方法是换引物。。。但是俺要扩的区域CG含量很高。。。换
了primer估计还会有类似问题。。。
对付high CG常用的DMSO/Betaine啥的，在real-time PCR中有没有类似应用？
求做过high gc real-time PCR的大侠指点迷津啊 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 49 只有多试几条引物了。
但我做的和你不一样，我设计的引物用普通Taq或者即使是专门扩高GC的kit也有很多非
特异性的，但是用Real Time的kit就非常好。 顺便说一下我用的是Brilliant
Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene)
另外引物拿到后就不要用普通的试来试去了，没啥意义，直接找几种做Real Time的kit
上就行了。 |
|
s**********r
发帖数: 1120 | 50 我用SYBR做QPCR检测细胞中shRNA的表达．因为对照细胞的CT没有数值（ＮＴ），所以
只能算deltaCT,(用U6miRNA做control)．我的shRNA的CT分别是29.43,31.56, U6 CT分
别是29.84,29.74，deltaCT就分别是-0.41, 1.82，对吧？那做图的时候直接用这个数
值就行了，还是要计算2(-deltaCT)？有明白的同学给解释一下吧，非常感谢． |
|
