a******p
发帖数: 414 | 1 1. abi miRNA profile based on Taqman PCR, 一个sample 大约 5000，dollar， 你
有<10个samples的话，10K肯定够了，好处是 它measure mature form of miRNA
2.microarray, available in affymetryix , exiqon ect, it should be 1K/
samples, 有很多假阳性，但总能找到一些
3.exiqon SYBR based miRNA RT PCR, ask the company directly，
4.a lab in our university developed a microarray chip and it is very cheap
but the quality is just so so |
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p********e
发帖数: 61 | 2 看了大家的回帖，很受感动。大家确实给了很多宝贵意见（只有一个例外）。总结一下
大家的意见和我的想法。
1. 如何真正实现供货，后勤，销售和市场营销等
这个我确实考虑了很多。我觉得基本上都搞定了。不过我还没有正是开始，不知道到时
会不会有新的问题产生。有一位有经验的大哥告诉我：遇到问题学会去解决就是了，你
们做科研难道不是每天都在解决新问题吗？我觉得这位大哥很在理，也很感激他。
2. 中国进货质量
生物试剂和电子产品一样，其实大多数都是中国生产。只不过贴了Invitrogen, Sigma
之类的标而已。我要做的都不是什么前沿试剂，都是常用的试剂，制造方法十分成熟。
比如单克隆抗体，Marker, Plasmid kit等，能有什么质量问题？大家去查一查AbCam的
单抗，看一看TDS,你会发现很多都与国内的某些小公司一模一样，原因在于它们来自于
国内的公司，只不过贴了AbCam的标而已。
关键还是在于我们对供货商的质控。我其实已经有很多供货商了。我本人以及一些朋友
正在做测试。如果过关我们才会贴到我网站上。（这就是为什么我网站上只有产品类别
而暂时还没有产品的原因）
不过如... 阅读全帖 |
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w****l
发帖数: 229 | 3 invitrogen的，不是常见的那个NCODE， 而是NCode™ VILO™ miRNA cDNA
Synthesis Kit and EXPRESS SYBR GreenER™ miRNA qRTPCR Kits。
我通过读那个manual,发现说这个cDNA形成之后，不能1：10dilute，而要用不dilute的
cDNA??
不是很理解，现在客服也下班了。
如果有人用过这个kit, 能帮我解决一下我的疑惑。 |
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a******7
发帖数: 7936 | 4 我靠，这得用掉多少sybr green啊！！！
会不会给实验室省钱啊！！！ |
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l******g
发帖数: 1145 | 5 我贡献一个哈，做克隆鉴定时，miniprep的试剂我都自己配，成本是一个miniprep2分
钱，反正只要能看条带就行了。除非要干净的DNA，才用kit。
做qpcr的塑料耗材，有家ABGENE的公司挺便宜的，和ABI的没啥区别。
Fermantus的限制酶，sybr green什么的，都是又便宜又好用。 |
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L*****t
发帖数: 56 | 6 这个东西不算太复杂，一个灯箱而已，而且我也觉得不是你弄坏的
自己做一个也很简单，就是做胶的时候要加Sybr Safe这样可见波长能激发荧光的染料。
我弄出最大的事情是离心机转子加速时突然松脱，报销SS-34一个和RC6+的转轴一根，
如实通知负责人之后认定是意外事故，也没说什么 |
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L*****t
发帖数: 56 | 7 这个东西不算太复杂，一个灯箱而已，而且我也觉得不是你弄坏的
自己做一个也很简单，就是做胶的时候要加Sybr Safe这样可见波长能激发荧光的染料。
我弄出最大的事情是离心机转子加速时突然松脱，报销SS-34一个和RC6+的转轴一根，
如实通知负责人之后认定是意外事故，也没说什么 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 8 So LZ can try this: SYBR Green based Real-Time PCR for screening whether or
not that outside gene its recombination or integration into Mouse tissue/
blood etc.
Reference:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3001095/
//www.springerlink.com/content/g1340707682358n8/
or |
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o***e
发帖数: 12 | 9 现在实验室用的有两种
一种是toyobo的SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus-
另外一种是genecopoeia的All‐in‐One™ qPCR Mix
好像两者的价格差别还是非常大的。
效果上我不太清楚，因为只用过前者
各位用过的能说说吗
谢了 |
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j*****q
发帖数: 82 | 10 sybr green的方法。primer express设计的引物， 没hairpin，没dimer，在载体上扩
增很漂亮，线性化也很好。但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
很接近，而且都偏大，28，29的水平。
这样的现象能是什么问题呢？引物本身的问题吗？
多谢了 |
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j*******g
发帖数: 10 | 11 thanks a lot!
Current Neurovascular Research
ISSN (Print): 1567-2026
ISSN (Online): 1875-5739
VOLUME: 9
ISSUE: 1
DOI: 10.2174/156720212799297100
PDGF Receptor β Signaling in Pericytes Following Ischemic Brain Injury
Author(s): Koichi Arimura, Tetsuro Ago, Masahiro Kamouchi, Kuniyuki Nakamura
, Koji Ishitsuka, Junya Kuroda, Hiroshi Sugimori, Hiroaki Ooboshi, Tomio
Sasaki and Takanari Kitazono
Pages 1-9 (9)
Abstract:
Platelet derived growth factor (PDGF)-B plays a neuroprotective role in
brain dam... 阅读全帖 |
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y****d
发帖数: 46 | 12 试试这个：
invitrogen SYBR® Safe DNA Gel Stain
还有配套的蓝光灯：
Safe Imager™ 2.0 Blue-Light Transilluminator |
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b*******0
发帖数: 125 | 13 想做miRNA qPCR。查了一下 选择了qiagen 的 miScript II RT Kit 以及miScript
SYBR Green PCR Kit。 这还提及 miRNA 提取试剂盒（mirVana miRNA Isolation kit
(Ambion)）的就吓了老板一大跳。贵啊！
求推荐。 |
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X***n
发帖数: 366 | 14 polyA polymerase
MMLV RTase
SYBR qPCR master mix
It's not complicate. Why do you need kit?
kit |
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I***a
发帖数: 13467 | 15 用的是Bio-Rad CFX 96 touch，感觉耐操，
有时候well读数会有问题，
然后就是一直用他家的试剂，什么sybr green，挺贵。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 16 If you use CFX 96 and got well to well variation, you should call bio-rad.
It is still one of the best out there. SYBR green are expensive. All the
RT-PCR reagent are expensive. Tell me which brand sells significantly
cheaper that works. Quanta is more expensive.
PS. I have been using RT-PCR since the beginning of the technology. |
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l***s
发帖数: 841 | 17 Life could give you a significant discout for their Power SYBR. I negotiated
with several companies and only Life got me the lowest price. For their
50ml bottle, try to see whether you could get at least 60% discount off
their listing price.
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f*******e
发帖数: 628 | 18 这是因为 life 的 invitrogen 自产 sybr 吧。
negotiated |
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D********0
发帖数: 409 | 19 用过abi 和roche的light Cycler 480.
probe和sybr都用过。
同样的sample 和reagents，abi的sensitivity要好很多，要高3个ct值。但如果是
relative quantification就无所谓了。
roche的过了40个cycles我觉得contamination的机会高些，通常delete。 |
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t**********8
发帖数: 223 | 20 这个kit说可以不用加dnase,大部分dna已经除掉了，对pcr一般没有影响。我试过 RT前
加dnase 和不加，用SYBR Green做qpcr，没有什么区别。但不知道对microarry有影响
吗？
啊？ |
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z*******6
发帖数: 679 | 21 对了，我现在都用SYBR green 10ul的体系... 也没什么问题... |
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r*******e
发帖数: 680 | 22 三个平行反应中有的差距很大
1. loading problem
2. bad PCR (if use sybr green)
. |
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n*******9
发帖数: 234 | 23 Yes, if you use SYBR, the diluted cDNA will postpone Ct value 3.32 |
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m***o
发帖数: 272 | 24 I am using sybr green qPCR,当测试primer时，用1,1:10,1:100,1:1000,1:10000
cDNA dilution.经常会出现这种情况:用所有5个浓度，primer efficiency会140%，如
果用最稀释的3个，efficiency会好些105%。查查是PCR inhibitor的问题。
如果这样的话，这个primer还是可以用的。
我的问题是：是不是应该把cDNA 也要稀释至少100倍才可以得到可信的结果呢？
谢谢！ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 25 limit应该是PCR Efficiency of certain primer pair
我以前做absolute quantification的时候，standard curve的dynamic range是10^6到
10^2
standard curve出来很好，从Ct值上判断再多一个1/10 dilution也是可以的
PCR Efficiency能够到1.8、1.9的话，测50个拷贝应该不是什么问题
但是现在大多数做qPCR的实验根本就不去测每对primer pair的PCR Efficiency |
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s******9
发帖数: 283 | 26 When you deal with less than 100 copies, you need to consider RT-PCR as a
series of random processes (e.g., Poisson): 1) template destruction, which
is significant for RNA templates, 2) distribution of successful cDNA
synthesis, and 3) distribution of successful cDNA amplification in each
cycle. Many stochastic variations can affect a final output. |
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a******a
发帖数: 283 | 27 Thanks for the input.
Chamgrape, we might be using different system, the way how we calculate and
express the PCR efficiency is by %. Mine's usually between 90-100% (good
range is 80% - 110%). What kind of samples you are using for "no problem
with 50 copies/well?". Are you using pure sample or you have to harvest the
samples with a matrix system (such as carrier RNA etc).
synbio79, i was wondering how much it can help to optimize the RT experiment
before doing qPCR. Have you done so? |
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C*******e
发帖数: 4348 | 28 我不知道这个80%-110%是怎么计算的
Bio-Rad有些好像是这样显示PCR Efficiency的
我说的就是自己做曲线，用质粒，因为浓度、大小（分子量）已知，然后推导
如果你说的80%-110%跟Bio-Rad家的一样，那么是还可以啦。
我说的case是cDNA，我没有做过carrier RNA
and
the
experiment |
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l**********1
发帖数: 5204 | 29 pls check a couple of years ago here similar post:
juzbox
2011-05-26 11:38:29
来自: 95.91.
4th floor
完全同意！
Biorad应该是性价比最好的，稳定性兼容性也不错。LC480使用超过2年之后问题接踵而
来，而且维护费用离奇的高，我们这LAMP UNIT接连坏了2次，维修报价直接让人吐血。
试剂耗材更不用说了，好在用的多，给打了非常大的折扣，但一般实验室如果不是当水
喝的话估计拿不到这个价格。板子我们后来用从另一个公司订制的，价格便宜一大半，
而且更好用。结果roche一听说我们要换板子，立马就表态可以match这个价格（之前怎
么谈都只同意给7折）。
其实实验室用过biorad的都觉得好，不过奇怪的是，一个非常重要的检测，只用用
LC480才能得到稳定的结果，biorad和ABI都不行（也许是相对老一点的机器的缘故），
所以老板就只认LC。当然，除了试剂耗材和维护费用，LC480也算得上好机器了
contract
括2台仪器加96well和384的探测头各一个（3年前的价格）。
c... 阅读全帖 |
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S**********g
发帖数: 109 | 30 我们用的是SYBR，下次我还是测浓度吧，谢谢
7 |
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m**o
发帖数: 1313 | 31 本来一直用SYBR safe, 400microL $59, 然后-15%.老板说贵，让找便宜的替代。
大家都用哪家的啊。。便宜好用的 |
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m**o
发帖数: 1313 | 32 谢谢了，那同事们得气死。。。找到一些替代的，挨个去要quote了，SYBR现在给了20%
off,还是不理想。。 |
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m**o
发帖数: 1313 | 33 回来update一下帖子吧，最后买了midori green advance,试了不错，很sensitive,比
SYBR SAFE省了三分之二的钱。 |
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C*********u
发帖数: 811 | 34 I have been using SYBR safe for 3 years and I found this dye was way less
sensitive than EB. I could never get very sharp marker using this dye unless
I ran the gel for a very very long time. Does any body have the same
problem?
Thanks! |
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i*****s
发帖数: 1170 | 35 SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain |
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z********8
发帖数: 818 | 36
can
the
完全正确。还有一个可能是仪器老了。 |
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l*******i
发帖数: 153 | 37 我做qPCR时，即使cycle达到35，36（endogenous control在16-18），replicate之间
也很少查0.5以上。
如果你对你的加样很有信心的话，注意两个问题：
1）你的板子是不是有点脏？
2）机器需要校验了。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 38 Did you check linearity of your primer? Seriously. |
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g******r
发帖数: 139 | 39 我没有把PCR产物跑胶，但是melting curve看起来很好。但是假设有non-specific
product,怎么解释replicate well之间的差异呢？ |
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A******y
发帖数: 2041 | 40 Melting curve or gel product do not tell you linearity. |
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l******a
发帖数: 3339 | 41 大牛来给我们讲讲吧，小的们实验不一定做得好，原理还是懂的。 |
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c****1
发帖数: 1095 | 42 不知你的replicates是怎么弄的，一般来说，对每一个反应，我是弄一个master mix
for 4.2~5 wells，然后充分混匀（这点很重要，我是用vortex），然后再aliquot到4
个孔里。重要原则就是要保证replicates都是一模一样的。我经常只弄2~3 replicates
。replicates的扩增曲线几乎完全重合。 |
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l***s
发帖数: 841 | 43 0.3-0.8 的误差已经很大了。一般来说不应超过0.3才对。很多人和我抱怨过qPCR，但
我发现他们大多数都用错了primer的浓度，根本没法保证efficiency。 每个primer至
少要0.2uM才行。 |
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g******r
发帖数: 139 | 44 Primer是从sigma买来的，都是选的cross exon-intron splicing site。但是假设是
primer不好，跟replicate well差异大有什么潜在联系吗？ |
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g******r
发帖数: 139 | 45 能展开讲讲么？primer lineartity对replicates的潜在影响是什么？谢谢 |
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g******r
发帖数: 139 | 46 当然对这样的实验使用total tube是必须的。
4
replicates |
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g******r
发帖数: 139 | 47 你说得很对，我实验中使用0.3uM的primer。但假设primer浓度不够，导致efficiency
不好，但这能导致replicates差异大么？理论上所有的well是一样的low efficiency。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 48 If you are not in the linear rage, it is very possible you will have
significant different C(t) when you do the experiment. The whole point of
out of linear range is that you will have erratic unpredictable data. |
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B******o
发帖数: 496 | 49 smear出现的话melting curve不会是单峰，很容易分辨的 |
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