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s******s
发帖数: 13035 | 2 花钱买吧，也就几百刀。从CDNA里面批太痛苦了，还有一堆mutation.
如果是gDNA也就忍了 |
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s********8
发帖数: 619 | 3 才用phusion P了一个5k的片段,测序了一个克隆,确实是一堆mutation.谁能告诉我为啥
?phusion不是号称high fidelity的么? |
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s********8
发帖数: 619 | 4 这个overlapping PCR 怎么做?从来没做过,求科普 |
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s******s
发帖数: 13035 | 5 商业宣传不能信啊，呵呵。主要是很多是polymorphism还有alternative
splicing, 也就是你的mRNA就是这样的。问题是你不知道哪些是这个，哪些
是pcr造成的 |
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s********8
发帖数: 619 | 6 polymorphism不应该造成氨基酸序列改变吧?我说的mutation是引起aa变化的那些,数了
一下,大概每kb有一个这样的mutation.我还没有完全测序我的克隆,但是按这个概率的
话就会有4到5个mutation,这个克隆是做表达用的,不知道会不会有影响,郁闷. |
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c******e
发帖数: 350 | 7 Thanks.
But maybe I didn't explain well what happened.
We set up 2 reactions with identical reagents on 2 thermocyclers as below.
thermocycler Capillary 96-wells
Ramp rate (C/sec) 20 2
PCR volume 10 ul 10 ul
Amplification success fail
The reason we changed the ramp rate is that 2C/sec is recommended for the
96-well thermocylcer.
We didn't change reagents or Taq, be... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 8 wow, 好怀念历史啊。
还有以前Taq都是home-made |
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b*******n
发帖数: 8420 | 9 那配合home-made Taq的就是手动PCR循环了？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 10 5k和8k都没问题
5k尤其没问题
用LA Taq+ high GC buffer I
引物设计特异一些
关键是你有negative selection marker么？
，A |
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y******8
发帖数: 1764 | 12 Find a biochem lab, borrow their columns to run one batch Taq purification.
Then, the product would be enough to run millions of PCR. |
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e*******e
发帖数: 1837 | 13 如果是SNP看看能不能找core做，那种有robot有raindance之类机器的地方价钱可以做
的很低。要是一定要自己做楼上说的自己提Taq是正解。 |
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c*******n
发帖数: 27 | 14 It generate only 15,000 units of Taq for 1L of culture? The production seems
way too low. How much is it according to your experience? |
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h****6
发帖数: 229 | 16 I have one in my freezer. However, i don't know if it is still alive. What
is your purpose? |
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s********n
发帖数: 2939 | 17 Go to buy, it is really cheap! Fermentas. |
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S********i
发帖数: 34 | 18 买去吧，你如果需要的量很大的话，站内短我，我告诉你一个公司非常便宜。应该比你
自己纯化便宜多了。
I |
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A*******e
发帖数: 284 | 19 很久不用taqman了 几乎忘了原理,你说你是在annealing后面收集荧光. 你用的机器我
没有用过,不清楚具体设置.你用的是两步法还是三步法. 尝试三步法在延伸后面收集荧
光.taqman好像依赖taq酶的外切酶活性对吧. |
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s******s
发帖数: 13035 | 20 taq 1min/kb, phusion 15sec/kb，不知道你说的啥酶 |
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W*********n
发帖数: 775 | 21 需要一个高保真酶扩增基因（从cDNA扩增,基因大约一两千bp），TA克隆入载体进行表
达。请教哪家的哪个产品最合适？
我看过invitrogen有一个“AccuPrime™ Taq DNA Polymerase High Fidelity”
，9X fidelity, 但是Product Overhang is Mixed .
还看过Qiagen的“HotStar HiFidelity Polymerase Kit”， 10X fidelity. 产物3'末
端加A.
大家都是用哪家的？请推荐一下。谢谢！ |
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s******s
发帖数: 13035 | 22 invitrogen plantium tag hifi
我们实验室就三种酶，home-made taq做colony PCR，然后phusion和plantium hifi
做克隆。这个比phusion慢，好处是加A而且phusion批不出的这个经常能work |
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y******0
发帖数: 6296 | 23 big cow是网络用语啊，晕死，我最近几天学了一下，不用测序，用taq探针 |
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s******s
发帖数: 13035 | 24 你咋设计的
给你几个hint
1.不要设计在CpG的地方，这个你应该知道
2.不要像普通PCR一样按照两条链设计，必须按照一条链设计
3.不要太长，200－300足够了
4.用Hifi Taq，普通酶和phusion有时候不work |
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Z******5
发帖数: 435 | 25 建议后面PCR多试几种不同公司，不同特点的酶。比如我当时就是用Takara的
Primerstar和GC Buffer的LA Taq。有时候，其中某些酶扩增很烂或者没有，而另一些
酶-Buffer就很好。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 如果你只是想要个平端的话，可以直接用klenow fragment 来把它补齐。
如果根本不想要那个多余的A 的话可以在反应结束后用pfu 处理。
谢！ |
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i***l
发帖数: 1656 | 27 frankly, this is kinda common sense
no protocol, but i would do:
clean up your pcr with any available kit, thrown in pfu +buffer; or else,
throw in klenow (NEB) directly into your pcr tube |
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g*********5
发帖数: 2533 | 29 only one A would be added on to PCR product.
and CloneJET PCR Cloning Kit have DNA Blunt enzyme. |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 哦，还真是呢。
听你这么一说，我认真想了想，其实klenow反而是有一定的3'-5' exonuclease
活性的，其实也能去除3'-A |
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y****d
发帖数: 46 | 31 感谢大家的帮助和讨论，再多问两句：
1. 加入pfu后的反应温度应该是多少？室温，37度，还是72度比较好？
2. 大概需要反应多长时间？是否有办法确定反应完毕？
对这个领域不太熟，见笑了！ |
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M*****n
发帖数: 16729 | 32 use T4 DNA polymerase without dNTP,
it will trim the overhang,
double-check manufacturter's manual, because I may have remembered it wrong. |
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y****d
发帖数: 46 | 33 谢谢！查了一下说明，发现这些酶都是需要在dNTP存在来切除overhang的。如果没有
dNTP的情况下容易造成3'端的凹陷。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 34 RE LZ:
pls try
Cassette-ligation downstream 3'RACE PCR
or Tail-PCR
Protocol:
看图说话
>
Amplification of FSTs by 3’-RACE
Total RNA was isolated using hot-phenol extraction
[27], from 20 ml cultures in 50 ml Falcon tubes on a rotating
wheel. Reverse transcription used the SuperScript
III First-Strand kit from Invitrogen in a DNA Engine
PCR machine (MJ research). Primer QT was mixed with
5 μg RNA, incubated at 65 °C for 5 min then cooled to
55 °C over 100 sec, after which the annealed mixture
was kept... 阅读全帖 |
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g*****n
发帖数: 250 | 36 It seems that your genomic DNA samples contain something that inhibits the
enzyme. I would use Taq since fidelity is not a concern in genotyping. |
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u**********d
发帖数: 573 | 37 你的不是5'缩进么，klenow只能补5’突出的吧。加A我记得只有taq才可以，而且是加
在3’。T4 DNA polymerase好像可以把3’突出切掉，不过你要的是补平。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 38 high fidelity?
我们用phusion，PCR 36个cycle以下基本没有突变，40个cycle的时候经常有突变 |
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s******s
发帖数: 13035 | 40 当然和保真无关，否则怎么卖plantium HIFI呢？
这玩意好像是加了一个抗体在低温下抑制活性。
BTW, 酶好不好用，除了保真，还有是不是好P。
这个Plantium HIFI我觉得很好用 |
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a********k
发帖数: 2273 | 41 同意，platinum hifi算是我用过的最好用的。比pfu，phusion，titanium都好用。 |
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w*****g
发帖数: 95 | 44 我实验室用PfuUltra high-fidelity DNA polymerase做mutagensis, 也是长片段pcr的
一个选择。phusion的确是快，原来两天活可以并一天了！ |
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q**********0
发帖数: 335 | 45 Thanks for the above sharing. Not sure how high the incorporate error rate
of phusion or PfuUltra high-fidelity DNA polymerase. Do both of them have
high-fidelity amplification? Thanks. |
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q**********0
发帖数: 335 | 46 Which company's phusion is better, Thermo Scientific or New England Biolab?
Thanks. |
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s******s
发帖数: 13035 | 47 pfu和phusion hifi都高保，但是pfu这玩意儿真是很难用啊 |
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s******s
发帖数: 13035 | 48 只用过thermo的，neb也出phusion了？
? |
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q**********0
发帖数: 335 | 49 Yes, NEB also has phusion, but they said theirs is from thermo. |
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j****x
发帖数: 1704 | 50 Phusion是Finnzymes的专利，以前一直是通过NEB代售。去年Thermo把Finnzymes给并购
了，所以后来NEB就推出了自己山寨版Q5。
BTW，NEB自己也产phusion。现在NEB还在买的phusion基本都是自产的了 |
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