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f**u
发帖数: 346 | 2 嗬嗬，既然说到突变率了，各位有什么好主意降低这个吗？
我用taq曾经有过400bp出现4个点突变的纪录，用的是标准条件，不是error prone，
好在是做probe，没怎么去管它，如果是做KO什么的不堪设想。
有时候用pfx扩不到1k的片段也能出突变，不光是点突变，还出过frameshift，
反正感觉我做PCR突变就特别多。 |
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y***j
发帖数: 11235 | 3 要做一个实验对fidelity要求很高,而且样品量很少,最后需要的产物量也很大.一般感
觉fidelity和yield两个比较难同时满足.
哪个牌子高保真做的比较平衡么? 这个有啥第三方的review么?国内时候用过takara的
primeSTAR感觉yield不错,fidelity没
法跟别的比较,但是这边好像比较少用takara.
正牌公司谁的高保真Ｔaq口碑比较好呀? |
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a********k
发帖数: 2273 | 4 Stratagene的Herculase II
在我手上比Invitrogen的platinum和pfx,neb的phusion要好
如果fidelity要求不是很高可以考虑clontech的advantage 2，产量绝对惊人 |
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h**********r
发帖数: 671 | 5 一直用Pfx,觉得不错。上周刚P了一把6.0kb的片段，GC含量超过70%,也没问题。
也有人用Phusion的。
这俩酶多不能直接AT克隆。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 6 取决多长片段
我用stratagene 的pfu ultra，觉得还不错
至少4k片段不成问题 |
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z*****k
发帖数: 86 | 7 我也用过这个 还不错
而且很快 我8k的片断延伸只用2分钟
不过发现有突变 |
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n**********1
发帖数: 251 | 8 sybergreen对于Taq酶本来就有影响，不知道qPCR用的是什么试剂，最好使用
masterMix，因为这些mix一般是经过优化的。 |
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q******g
发帖数: 3858 | 9 不同机器。试剂用的是Qiagen 的hotstart Taq master mix。有人告诉我sybergreen会
有影响，没想到会这么大。看来在摸条件的时候，就该sybergreen 加进去了。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 10 (1) after cycle 30, stop your PCR, add fresh dTNP and Taq, run another 10
cycles.
(2) use PCR clean up, but not gel purify.
(3) just more reactions. |
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m**i
发帖数: 47 | 11 多谢指教!!因为PCR product之后要做digestion和ligation, 那PCR clean up如果用
kit的话也要好几百个了吧.还是用phenol/chloroform去protein,或者还有什么更方便
快捷的办法去掉taq和dNTP呢? |
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a***e
发帖数: 1010 | 12 for Taq and dNTP, phenol/chloroform is enough. Problem here is your primers
. |
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a******e
发帖数: 119 | 13 我在用Taq DNA ligase将两个富含GC的约70bp的单链DNA片段连接。 直接连，没连上。
又95度加热10分钟，cool down overnight，再连接，还是没连上。 请教各位有什么建
议么？
另外如果把单链变为双链后再连接，怎么由双链的DNA在获得单链。 Thanks |
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a****o
发帖数: 1786 | 14 Yes, if you overdid PCR, you will see this phenomenon. Doing PCR for a
fewer cycles may cure the problem. I don't think it is dissociation. When
primer/dNTP/active Taq goes down, annealed DNA-Primer can not be
formed/extended. DNA molecules with different sequence in middle form
duplex. Since they have identical sequences at both ends due to constant
regions, but different sequences in the middle, they can not form perfect
duplex, rather they form partial duplex at both ends, while loop-out
sing |
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a****d
发帖数: 1919 | 15 从起始密码子开始，序列是这样的：
ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
gene本身65％GC含量,1.3Kb
打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？ |
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s******r
发帖数: 2876 | 16 你先看看这个基因有没有的卖，用纯的plasmid作template容易一点。
在你可以考虑在atg之前寻找合适的primer，先得到PCR product
然后再PCR ORF。
roche有一个high gc的PCR kit，用过还行。
从起始密码子开始，序列是这样的：
ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
gene本身65％GC含量,1.3Kb
打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 17 如果怀疑是仪器的问题的话
不如直接找公司
让他们给你们做出个PCR出来
或者给出建议 |
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r*****m
发帖数: 231 | 18 把需要的位点设计在PCR引物的两端，PCR后用酶切然后连上vector。你的Lenti vector
应该至少有7，8kb吧，连个4kb的一般不会出问题。一般人做PCR cloning都是这么做的
，做不出来的才用TOPO。但你是TOPO都做不出来，就不知道为什么了。。。检查下你的
Taq是不是有问题吧。。。 |
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R*****o
发帖数: 14902 | 19 I did that before. I also made my own Taq polymerase. |
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l******n
发帖数: 105 | 20 因为冻融可能影响Taq酶活性，所以避光放在4C临时保存最好。 |
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r****r
发帖数: 379 | 21 我觉得基础研究对应用的贡献有以下几个方面：
1，提供一个可以让信息充分交流的local community。
müller起初的想法是不错，不过最初的pcr是几乎不能用的，直到后来一个小日本找到
了taq酶，然后做改进才慢慢变得可用，这里面涉及到很做信息沟通问题，这要是在中
国一个角落有人想出了这个想法，估计八辈子也接触不到嗜热菌里面的一个酶这样的信
息。很多技术改进，需要一个很庞大的基础研究的community，里面有很多信息可以用
来share，光靠pubmed是不行的，面对面的交流很重要。虽然现在国际交流很多，但国
内有这么一个community，会大大提高效率和合作的成功率。
2，提供一个可以及迅速展开技术合作的的local community。
RNAi是一个很好的例子，一个基础研究获得重大突破，并不是简单的看文章就能迅速跟
进的，不然大家也不需要出国读书了，或者读了phd不用做postdoc了，是不是在实验室
看看文章就能马上跟进一个领域呢？对这个领域的发展方向的理解，对很多技术细节的
理解，是不是在外面看些文章就能迅速跟进的呢？RNAi当初出来，alnylam公司现在控 |
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e**r
发帖数: 1144 | 22 taq酶是个台湾人纯化出来的
作为我国科学家的重大贡献写入了中学生物课本 |
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e****p
发帖数: 354 | 23 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
)，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢 |
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k****l
发帖数: 279 | 24 When I design the primers with primer 3, I make the optimum Tm to be 60C
The real Tm maybe several degrees different
But I don't care. I always use 55 for annealing when I use Taq
Doesn't matter for most cases |
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C*******e
发帖数: 4348 | 25 如题
Phusion Hot Start II和Herculase II该选哪个？
还是PCR的问题
Pfu Ultra II、Taq一开始都扩不出来
后来发现是模板的序列跟我们手上的序列不一致
现在根据测序结果设计了引物
Pfu Ultra II只有非特异产物出来
目的片段不算多大，4kb不到
GC含量也没有特别高，60%而已
一般的优化都试过了
现在老板支持买别的酶试试
大家说选哪个？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 26 Invitrogen Platium HIFI Taq |
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D*a
发帖数: 6830 | 27 Platinum®Taq DNA Polymerase |
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O******e
发帖数: 4845 | 29 你得首先确认你做的实验，在技术上没有出现问题。比如说这个PCR，你是用的什么
酶？普通的Taq还是其它的？你的PCR产物到底有多大？ |
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a***e
发帖数: 1010 | 30 generally speaking, if your tumor samples come from microdisection,they are
supposed to be a clone and should not contain variations in the same
microdisected sample.
In your case, a regular Taq enzyme can generate several point mutations
during PCR, if the product size is around 1kb.
bp |
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g******1
发帖数: 244 | 31 不需要线性化，直接在两头引物加两个位点，PCR以后双酶切，或者末端填平磷酸化自
连转化扩增后再双酶切。LA-taq突变率挺高的，建议phusion。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 32 用taq克隆了一段时间发现有突变，于是从stratagene买了pfu回来。。。
结果就杯具了。。。都摸了1周多条件了。。。
我要p的是cDNA，从公司买回来的vector。。。
primer1的Tm在55度，primer2的Tm在57度。。。于是我annealing temp用50度走。。。
看到instructions说amplify cDNA，要加Mg到3mM。。。
于是我就照做了，
那次很幸运，出现了条带，可是我再用同样的条件去重复，就是出不来条带。。。
唉。。。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 33 1。您的意思是比如说50ul体系用0.2ul pfu, 加0.6ul taq？太多了吧。。。
2。pfu应该要hot start吗？
谢谢。。。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 34 annealing太低，IDT算出来的都是不准的，建议用gradiant试一下52/55/57,
尤其多加Mg效果就类似降低annealing。另外用pfu你的延伸时间太短了。
建议用Taq+pfu, 注意hot start
94*2 － （94*0.5 -> 52/55/57*0.5 ->72*2) *35 cycle -4C |
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n***w
发帖数: 2405 | 35 今天多加了点模版，然后用pfu和taq混合，3:1，pcr，条件没变，然后出了条带，然后
回收了。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 36 嗯，我今天把pfu和taq混一起跑了，跑出来了。然后切胶回收了。
谢谢。
的？ |
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S*******m
发帖数: 34 | 37 当心突变.理论上讲pfu不会correct Taq 产生的错误.记得测序完了上来汇报一下. |
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S*******m
发帖数: 34 | 38 这个'6倍'是否有据可查? 另外,不是说用3倍于pfu的Taq吗?
减速说明合成还在继续,高保真酶怎样修复? 把pfu拽下来自己上去?
这个'掉落'有多大可能是一个很关键的问题. |
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n***w
发帖数: 2405 | 39 上次买的phusion来了，然后用pfu+taq弄出来的做模版用phusion做，相当impressive
！！！！
回收率也不错，明天直接把pcr产物送过去测序看有没有mutation。估计周五就知道结
果了，大家也就别争拉。
谢谢各位的帮助。 |
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s****t
发帖数: 461 | 40 Anal Biochem. 2000 Aug 15;284(1):11-8.
Discrimination of primer 3'-nucleotide mismatch by taq DNA polymerase during
polymerase chain reaction.
Ayyadevara S, Thaden JJ, Shmookler Reis RJ.
please send it to s******[email protected]
thanks |
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s******s
发帖数: 13035 | 41 一般promotor先做，序列短点（200－400bp），长的不好批。
35－40cycle, 68C延伸，尽量用好酶，比如plantium hifi taq
区？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 42 说到这个钱的事情啊，对于有些人啊，比方说我，肯定是一个财迷，而且
有点神经质，容易紧张，一旦发现实验室没有申请到funding会紧张的睡不着。
以前第一个老板，就是graduate school时候的导师，从一开始一直都没有钱，
只有我一个学生，而且每年只有系里发的几千块科研费用，弄得我每天都过得
很惊慌，连pipet tip 都不敢多用，而且很多试剂都要厚着脸皮找别的实验室借，
包括浓盐酸。。。而且所有瓶子都是我自己动手洗，做生化试验的时候都是
做两天之后就必须停下来用一天洗瓶子，不然下面就没有容器用了。
（咳咳，那个河马和ahche,你们注意了，我洗瓶子可是熟练工）。
而且我借试剂和借仪器的时候经常是脸皮极厚，有的试剂比如说内切酶，连接酶，
以及taq,我一直是几年如一日的去借着用，居然就没有去order 过。幸好系里
大多数学生和我关系都不错，除了偶尔拿这个和我开开玩笑之外并不会为难我。
只是几个老板一看到我窜到他们的实验室来了就额头上浮起几道黑线。哈哈哈。
后来熬了好几年，老板终于申请到了一个大grant, 然后我第一个反应就是
赶快订了一大堆pipet tip, 然后坐在小山... 阅读全帖 |
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f********n
发帖数: 6465 | 43 发信人: sunnyday (艳阳天), 信区: Biology
标 题: Re: 哎，我也上来要个安慰
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Nov 8 08:57:56 2010, 美东)
说到这个钱的事情啊，对于有些人啊，比方说我，肯定是一个财迷，而且
有点神经质，容易紧张，一旦发现实验室没有申请到funding会紧张的睡不着。
以前第一个老板，就是graduate school时候的导师，从一开始一直都没有钱，
只有我一个学生，而且每年只有系里发的几千块科研费用，弄得我每天都过得
很惊慌，连pipet tip 都不敢多用，而且很多试剂都要厚着脸皮找别的实验室借，
包括浓盐酸。。。而且所有瓶子都是我自己动手洗，做生化试验的时候都是
做两天之后就必须停下来用一天洗瓶子，不然下面就没有容器用了。
（咳咳，那个河马和ahche,你们注意了，我洗瓶子可是熟练工）。
而且我借试剂和借仪器的时候经常是脸皮极厚，有的试剂比如说内切酶，连接酶，
以及taq,我一直是几年如一日的去借着用，居然就没有去order 过。幸好系里
大多数学生和我关系都不错，除了偶尔拿这个和我开开玩笑之外并不会为难... 阅读全帖 |
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w******a
发帖数: 1527 | 44 实验室里冷极了，没有窗户，不知道是白天还是黑夜。这是一周的最后一天——周 末
。在这又冷又黑的晚上，一个蓬头散发的小女孩在试验台前坐着。她从家里出来的时候
还穿着一件外套，但是有什么用呢？那是一件很大的外套──那么大，不知是哪一年
买 的。她工作的时候的，就穿上白大褂了，实验室的师弟嘲笑说，何必穿实验服呢，
你的破大衣都可以当抹布了。
小女孩只好一个人做实验，一双小手被PE手套捂得苍白。她的面前的胶板上有一串
点样孔，还有好几管菌落pcr产物。这一整天，目的基因还是没连上质粒，谁也没帮过
她。
可怜的小女孩！她又冷又饿，哆哆嗦嗦地点样。灯光落在她的干枯的长头 发上，
那头发卷曲着披在肩上，看上去很久没梳，不过她没注意这些。每个桌上都堆满 了文
献，实验室飘着一股LB培养基的香味，因为这是老板催要结果的时间——她可忘不了这
个。
她在上完出某个样后停了下来，蜷着趴在桌子上。她觉得更冷了。她不敢跟老板说
，因 为她试了所有的taq酶，试剂盒，质粒，没p出阳性的菌落，老板一定会骂她的。
再说，换做别的题目跟这个一样难。她们头上只有pap... 阅读全帖 |
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y******8
发帖数: 1764 | 45 Just think about the enzyme responsible for the DNA replication in this
bacteria strain.
The last example is Taq. |
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f*******e
发帖数: 354 | 46 我不是要扩增长片段 我只是要做single cell或极少量RNA RT来的PCR，就是常规的RTp
cr 但是模板量极少。kit里都有带的DNA polymerase 但是都非常少 很快就用完了 但是
还剩下很多的cDNA和RNA 用自己的普通taq酶好像不怎么灵 所以请教大家有没有用过什
么NB的酶 很多公司的牛酶都是宣称长片段 高保真 但是没有说高效率（灵敏）的 |
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s********n
发帖数: 2939 | 47 5 kb不算长吧，如果只是鉴定用的话用一般的Taq应该没问题的，Fermentas的DreamTaq
便宜量又足，manual说可以扩增genome 6kb片段和viral的20 kb片段。我用来检测过3
kb片段。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 48 5 kb不长
随便扩扩基本上都能出来啦
当然模板特别难扩那是例外
Takara的LA-Taq是好，不过拿来扩5kb的实在有点大材小用
我用它扩>10kb的 |
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zc
发帖数: 111 | 49 100ul，100 cycles，taq, primer等都用终极的dose
不用hot lid
最后会浓缩到15ul左右，估计DNA浓度差不多了 |
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c******r
发帖数: 3778 | 50 pcr一般产物浓度在200nM就是不错的了。
主要是PCR的增加是exponential的，在20多cycle的时候多数都已经用光primer和dNTP
了。如果增加primer和dNTP的浓度，要知道，就需要exponentially increase。但是过
多的这些东西会抑制Taq的活性，所以一般跑30个cycle就到头了是有道理的。
如果实在需要那么大量的DNA，不如把PCR product给clone了，那就想要多少有多少了。 |
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