c********u
发帖数: 250 | 1 PCR tdtomato 总是有两条带, 大的1400多是对的,小的差600多,我知道tdt是dimer,可
是tdt 5' 3' 各有21和24bp是unique的啊,我用的就是这些primers,肯定不包含在重复
的那部分里,为什么还有两条带呢? PCR条件,62-55 touchdown,普通taq. |
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d****d
发帖数: 214 | 2 I remember I once compared tdTomato and dTomato but didn't see much
difference, thus we opted for dTomato. |
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b********t
发帖数: 108 | 3 有没有人用过tdTomato 非rabbit的抗体，谢过了。 |
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m****r
发帖数: 383 | 4 想问一下，如果用于detect tumors in deep tissues,Tdtomato是不是也就够了? 考虑
买一个Tdtomato single labeled的cell line, 比double labeled 的便宜1000刀呢。
penetrate |
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h**********r
发帖数: 671 | 5 dTomato和tdTomato好像还不太一样，tdTomato是dTomato的串联吧。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 6 建议换一个reporter, 比如用tdtomato reporter.LacZ 总体来来说不如Tdtomato敏感
。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 You should use Tdtomato, because it is bright and because it avoid most of
the intrinsic fluorescence (which is kind of green).
I won't use luciferase because it is hard to get the substrate to penetrate
the cell. |
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z****u
发帖数: 1007 | 8 Jeff Bush啊 我想标记效率肯定和部位有关。 在我检测的craniofacial region里面都
还不错。 不过确实应该拿多个line做比较，所以现在我们也在找别的line 包括PDGFrb
-Cre 还有Glast1-Cre
我们的NG2-Cre 以及CreERT都是Jax的。
ZsGreen是Allen Institue的Hongkui Zeng建立的，同时她还建立了另外很多个
reporter ，我用过的TdTomato, EYFP, ZsGreen都非常好。
Millipore的NG2 Ab我也在用，感觉不做antigen retrieval染的效果不太好。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 9 谢谢。
我用过TdTomato的，不错。
retina做flatmount，要除掉vitreous，小鼠的vitreous还挺难弄的，这个也可能是我
染色不太好的原因。
因为retina里面，pericyte to endothelium ratio是所有器官里面最高的，比脑子里
都高。所以用retina来看pericyte，应该是不错。
PDGFrb |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 E.coli？ 这个比较麻烦，虽然我没有直接经验，但是在我印象中，很多荧光蛋白的
codon被改过用来适应哺乳动物的表达，所以你可能要把你想用的几个蛋白的codon
检查一下（有专门的网站程序做这个事情的）
至于说颜色嘛，CFP, YFP, CheerryFP 应该就足够可以分开了。
但是最好不要用tdTomato, 因为可能会把蛋白变得太大，细菌表达系统对那么大的蛋白
不是
很适应。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 12 推荐JAX的 ZsGreen flox 和 TdTomato flox. Allen Institute的Hongkui Zeng建的。
都是非常好的fluorescent reporter. 能直接看到荧光。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 13 Hongkui Zeng的TdTomato flox. 确实很强，我们建了个全身敲除的positive对照系，
大白天老鼠都是红的，都不用做genotyping。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 14 tdtomato Jax 007909
zsgreen Jax007906 |
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w*e
发帖数: 740 | 15 准备设计几个复杂的载体，
需要用到EGFP TDTOMATO等荧光蛋白，为了节约时间准备全部合成大片段的序列。
从文献查得序列都不太一样，请问有无一些网站比较精确地罗列出了这些基因的序列
谢谢 |
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X***n
发帖数: 366 | 20 Co-ask. It happened all the time when I did the colonial PCR. |
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d*p
发帖数: 534 | 21 If you are using lenti-vector, recombination might be the reason. |
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z****u
发帖数: 1007 | 22 leaky 是组织细胞腐败降解了。 跟冻融没关系。单次的组织冻融不影响，比如-20度保
存很久的老鼠解冻后再固定也没啥问题。 leaky一旦发生就没法解救了，sample只有
扔掉。所以我的sample都是杀死后立马扔PFA. 一般来说GFP或者TdTomato 都不会被PFA
灭掉。 实在灭掉了那就上Ab . 很多公司都有很好的GFP antibody.很特异，很强。
组织一旦固定了就不用担心leakage 了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 我想原楼主说的就是tdTomato 吧？这个应该到处都能找到 |
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X******n
发帖数: 914 | 24 我用过的是tdTomato，是个tandem dimer。没用过dtomato，但这个可能会导致你的蛋
白形成dimer。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 25 可以固定后直接OCT包埋。不过sucrose， OCT浸泡后再包埋形态会更好。sample不会是
透明的，PFA固定后都是有些褐色的，很容易就知道切到哪里了。
37度一天对荧光没有任何影响。别说一天了。。我的需要脱钙的sample经常室温EDTA脱
钙个把星期都没问题。 TdTomato非常稳定。 YFP我不太喜欢，也不是很熟悉其稳定性
。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 26 我来设计个。
以某个stem cell specific marker X 为例,做一个tetra-alleles model
X-CreERT;Tdtomato flox;X-rtTA;TetO-H2BGFP
在开始时候同时加以tamoxifen和Doxycyclin短暂诱导。 前两部分做lineage tracing.
后
两部分作为初始标记。H2BGFP是个long live protein .只要细胞不分裂，其能在细胞
内维持一年以上。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 27 稍等。。还有个简单的模型
X-CreERT;Tdtomato flox;rtTA flox;tetO-H2BGFP 后面三个strain在JAX都有
不过这个模型好像只能证明X+ stem cell是quiescent。也许可以拿来检测在某些病理
条件下quiescent stem cell有没有 quiescence loss |
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z****u
发帖数: 1007 | 28 ZsGreen很好。很强。缺点是在细胞内会聚集成颗粒状。
红色里面Tdtomato，DsRed都很好。
当然我这都是来自于mouse的感觉，不知道对你的in vitro是否一样。in vivo，我也感
觉EGFP太暗了。 |
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h***9
发帖数: 662 | 29 老鼠长了个tumor,来不及做flow （to sort tdTomato positive cells),想冻起来以后
再做。有什么注意的？我查了一下，有两个方案：
1.放在cryoprotectant里面， 比如DMSO，冻起来。
2. make single cell suspension, 然后保存在ethanol里面。
另外，以前直接冻在-80度的tissue (没有cryoprotectant) 可不可以拿来做flow?
有没有专家给点建议？谢谢。 |
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