n***w
发帖数: 2405 | 1 GST-fusion protein,
bind完后用elution buffer洗出来了，然后pool，然后dialyze back to PBS (pH 7.3)
，dialyze完我测了下pH是7.56，然后加thrombin，切了一会儿就出现precipitation了
，根据我上次的经验，precipitates里面90%是我需要的蛋白。
现在一个问题是，为啥会有析出？我加完thrombin切的过程中测了一下pH，起码1个小
时的时候pH没有什么变化。。
所以想，是不是因为切了以后蛋白结构变了，疏水性增加？
这个116kD的fusion protein里有18个cysteine，结合之前有人发的帖子，我在想，是
不是这个原因？
谢谢。 |
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t********m
发帖数: 2 | 2 I had the same problem once. No good way to improve it. Two pieces of
suggestion:
First, try different amount of thrombin, different incubation time and
different temperature.
Second, try different enzyme.
My problem was solved by adding a TEV cleavage site between the GST and my
target protein. TEV is a very sequence specific protease. My protein was
purified by glutathione column and eluted with TEV enzyme. It worked. |
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t********m
发帖数: 2 | 3 yes, 4oC o/n or 37oC 5,30,60 and 120min. If you do in column digestion, you
need more enzyme and your protein sample will be diluted, but you do not have
to remove the GST. To my experience, the efficiency is better. There is no
quick way to remove thrombin or GST. Any way if you want to have high quality
protein, you have to use chromatography or HPLC. In my case, after monoQ, I
got single band coomassie blue band on SDS-PAGE.
degraded
any
be
protein |
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l*****u
发帖数: 11 | 4 好像公司卖的thrombin都是从plasma 提纯的
不知道有没有用recombinant 的方法自己制的
如果有的话， 你的plasmid 从哪儿来?
能否给个出处文献
多谢 |
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J*****n
发帖数: 1041 | 5 请问各位作蛋白纯化的同学，如果有GST tag需要用Thrombin去掉，你们都是用买来的
酶么？因为纯化蛋白需要太多酶，买酶实在是花费太大。:( |
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l******l
发帖数: 2651 | 6 来自主题: SanFrancisco版 - 请教止血药 Thrombin?
In my vague memory, gelform Thrombin, form gel sponge, are easier to get
than liquid like.
If you intent to use that outside US, check a doctor first. Some drug
additives smoke this kind of stuff. I forgot the particular name. |
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w***a
发帖数: 4361 | 7 俺正好用过这个pGEX-2TK, 它这个Kinase recognition site不是酶切用的，Thrombin的
切点在旁边的位置。
如果原核表达出来的蛋白，需要同位素标记的话，可以利用这个Kinase识别位点做in v
itro kinase assay。如果你表达GST-fusion蛋白的目的是为了检测这个蛋白是否能被某
个kinase磷酸化，那就不建议用这个载体，否则就无所谓。因为用Thrombin可以把所有
的无关序列都给切掉。 |
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c******k
发帖数: 8998 | 8 前面说instantly stop bleeding，结果后面说：
In tests with animals at Ferrosan, the coated sponges were applied to wounds
, with light pressure (from a human thumb), for 60 seconds — and stopped
the bleeding within that time. Sponges lacking thrombin required at least
150 seconds to stop the bleeding. A simple gauze patch, applied for 12
minutes (the length of the experiment), did not stop the bleeding. |
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l*****k
发帖数: 587 | 9 how about do southern to get physical restriction map(if you have probe for the
gene you want?)
Actually the question you asked is weird, to me :)
if you want to do funsion construct for expression, should you use cDNA??? why
you bother to go after BAC, I think they are all genomic DNA
for expression, the best system I ever used is the PET30(a,b,c) system, all my
proteins got very strong expression, HIS6 helps to purify protein using Ni+
column, thrombin can be used to remove the fursion part fr |
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h*****o
发帖数: 342 | 10 tPA是tissue plasminogen activator，是一个蛋白酶，主要功能是把plasminogen转变
成plasmin。Plasmin也是个蛋白酶，主要功能是把降解血栓。
大部分的中风都是缺血性的中风，是一根或者几根主要的脑部血管栓塞引起的。血栓形
成本身涉及了许多蛋白酶，重要的像thrombin，还有血小板上面的一些受体。所以一个
治疗思路就是抑制这些蛋白酶活性，阻断血栓的持续形成。另一个思路就是加入像
plasmin, plasminogen, tPA这些酶，降解已经形成的血栓。大概是三十年前开始就陆
陆续续在动物模型里测这些小分子化合物或者这些酶。常见的一个问题，当你抑制了血
栓形成的过程，一旦你的脑血管受到损伤，这些血管附近很容易有脑溢血以及相关的组
织损伤。所以这本身是很矛盾的。绝大部分的药都是因为有过多的脑溢血症状被淘汰掉。
tPA最早在八十年代中旬开始兔子上测的时候效果很好，在九十年代开始进入临床实验
，到九十年代中正式被FDA批准。它的一开始的有效期是在中风发生后的三个小时内从
静脉注入，病人的康复比例比不用药高了10%左右。但是使用tPA的病患有更高 |
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w********r
发帖数: 1431 | 11 你可以在his tag和你的protein之间加一个Thrombin或者某个protease（比如3C）的切
点，
纯化好之后可以把tag切掉。
不过有时候有些蛋白在Ecoli表达很差甚至不溶，可以在his tag之前再放一个Trx帮助
蛋白表达，表达好之后所有的tag都可以再切掉的。 |
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a***a
发帖数: 40617 | 12 save ur time
我知道不止一个人尝试自己干这个
还包括从粗制品里继续提纯，最后都放弃了
不值得那个精力 |
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n***w
发帖数: 2405 | 13 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
我设计了一个质粒，想表达一个fusion转录因子。但是从sds－page上来看，没有
overexpression的迹象，但是做wb，用该转录因子的抗体可以看到条带，虽然不多。用
gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段，也就是说，表达的蛋白被
chop了，即使bl21是protease deficient的。。。
现在都不知道怎么办，应该用病毒表达这种full-length的？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 14 I only did one dosage curve -- it has the right trend, but I don't intend
to include the data anyway. the point of my project is, here I generated
a new aptamer pair for sensor ppl to play with (just google thrombin
sensor you'll know how those ppl are lol~), for assurance I demonstrated
they can give higher signal with target than w/o, and the signal is
specific to the target. I'll leave claims about sensitivity & stuff to
sensor ppl. end of story (hopefully).
anyway, thx for your time~
a |
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w******e
发帖数: 1187 | 15 it's very easy to couple aptamers to sensor. in fact sensor field
is dominated by aptamer as affinity agent as the stability &
reusability is a big deal for sensors.
back to your questions, you can do thiol-gold, EDC-NHS, biotin-SA...
all you need is to synthesize the aptamer w/ desired functional group.
so are you doing arrays? or beads, like luminex? you may want to check
out larry gold's recent publication
I'd certainly like to, if it doesn't take too much time. any suggestions?
I'm confiden... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 1187 | 16 sullenger是gold的postdoc，famulok是szostak的postdoc。john lis不知。
shi hua和版上某牛人是john lis的postdoc/phd。tan weihong是半路出家的化学牛
人。li yingfu不知。谁给补充一下？
尤其tan组，现在基本dominate cell-SELEX并搞了n种cell-based aptamer
application
，很不容易，很佩服。打江山的shangguan回国了，现在还没有大paper面世，可能在
攒ing。
aptamer paper虽多，大部分都是拿个thrombin aptamer搞各种sensor platform，不
厚道说其实是打酱油的哈哈~作应用的只有tan组、langer组、ellington组、lu组、
li组我比较看好。 |
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h*****o
发帖数: 342 | 17 什么是thrombin aptamer，有没有入门文章看一下？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 18 aptamer against thrombin protein.
I guess you are interested in application of aptamer. Lu Yi, Andrew
Ellington,
Tan weihong, Li Yingfu each published an aptamer-sensor review last year.
you can start from there. |
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h*****o
发帖数: 342 | 19 很多GPCR都是dimer
我研究过一个叫PAR1的GPCR，它能被很多蛋白酶激活，像thrombin, APC, MMP1,
plasmin，等等。那同一个受体怎么能介导不同的信号通路呢？最近发现某些蛋白酶（
比如APC)是先结合到一些特异性的膜受体上(比如EPCR)，然后再就近切PAR1。所以你说
这种同类聚集的特异性是有可能的，也许还是必要的。 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 20 Do u have a cleavable His-tag on you protein? Sometimes protein (esp
membrane protein) has a low yield which can not be found by comparing
induced and non-induced samples.
If your protein is really important for you, try add a Thrombin, TEV or SUMO
protease cutable His-tag and do a simple separation with Nikel beads. Then
check if there is difference between SDS-PAGEs with and without protease
incubation. Good luck.
IPTG), spin |
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n***w
发帖数: 2405 | 21 Hi, all,
I am using Rosetta-Gami DE3 pLySs to expression my fusion protein which is
predicted as 91kDa.
I first did the expression assay and found protein expression was induced
after adding IPTG by testing the whole cell lysate. (bacteria at certain
time points, add 2X sample buffer, boil, SDS-PAGE).
Then I moved to culture more and lysed the cells using a sonicator, after
resuspending the pellet with 1x cold PBS/1% PI. After all these, I loaded
the supernatant and pellet side by side and stain... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 2939 | 22 Then I moved to culture more and lysed the cells using a sonicator, after
resuspending the pellet with 1x cold PBS/1% PI. After all these, I loaded
the supernatant and pellet side by side and stained by GelCode and a bulk of
protein (I assume it was protein) was detected in the pellet part.
你有没有在supernatant中检测到你的target protein？如何检测的？WB or activity?
从你的表述你好像没有做WB。
Then I tried 1L culture and repeated the 2nd experiment. This time, I
incubated the supernatant with glutathione sepharose 4b beads an... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 23 我对我自己已经很无语了。
之前已经说了提蛋白，用beads，然后必然就是purification了。
我用的是pGEX2T，所以使用thrombin来切掉GST-tag来释放my protein of interest。
室温切o/n。
然后用cold 1x PBS (pH 7.3)洗脱，奇怪的地方是，极少极少的蛋白被洗出来，几乎所
有的protein of interest还是在
beads上。。。。
大家可以看附件，下面那个一大坨是GST, 上面一个一大坨就是我想要的蛋白。。。。
我不知道该怎么办了。。。。
大家一起帮我troubleshooting一下吧，希望有前辈以前遇到过类似的问题。
用google搜出了一个这个帖子，情况和我很类似，但是貌似最后也没有什么办法。。。
最后一楼的方法我在犹豫要不要试
一下。。。
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/5431.html
非常感谢！ |
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n***w
发帖数: 2405 | 24 嗯，应该是可以的，我打算下次试试先用elution buffer把GST－fusion protein洗出
来，然后再用thrombin切着试试。
谢谢。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 25 okay, 大概是这样的，
thrombin切后，离心，此上清为eluate 1, 然后再用cold 1x pbs洗4次，跑胶，发现没
有目的条带，几乎所有目的条带都
是在最后beads fraction里。怀疑是目的蛋白本身和beads结合，而不光光是通过GST－
GSH结合。
然后用reduced GSH换出GST，然后用1M NaCl洗beads，希望能够破坏蛋白和beads间的
作用，但是没用诶。。。
所以我想要不要试试magnetic beads。。。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 26 乱猜一下，感觉这个更像是蛋白在Beads上Denature了。
你说的“最后Beads fraction”是用SDS之类的变形溶液洗下来的吗？还是GSH洗下来的
？都被Thrombin切开了（有没有试过GST elute下来以后再切？我猜你是在Beads上切的
）？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 27 18个cysteine，估计有不少的disulfide bonds，你是表达在E. coli的cytoplasm？如
果是的话，misfold的可能性很大。GST增加了fusion的可溶性，切掉以后就沉淀了。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 29 Sadly, the truth is that the protein you are working on is likely to
precipitate out by itself. The GST tag increases the solubility of the
fusion protein.
Man, doing protein expression is nothing more than gambling or trading stocks.
割肉吧。
3) |
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s*******e
发帖数: 1010 | 31 换个真核的表达体系吧，或许会对folding有帮助，当然前提是值得这么去试 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 33 没那么麻烦，GST-lif expressed in e coli
然后纯化，然后thrombin切割
大概一次提个1mg 蛋白，随便用在mESC 细胞培养里面，没有问题的
我都做过N次的，简单的一壶， |
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l*****5
发帖数: 197 | 34 是一个His, 一个GST tag的
切这个问题好像有点麻烦，因为都是thrombin的，所以一切就都没了，而且不知道
efficiency如何，现在lab里别人做的都认为切的效率太低。
我先试试浓缩，有没有可能在beads上直接反应？ |
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b******n
发帖数: 4225 | 35 我想到的两个解释
1）你的蛋白切掉GST之后本身aggregate或者形成oligomer
2）看你的GST是怎么切的，如果是in column digestion，有可能是molecular
chaperone
bind到你的蛋白上了。检测的办法是不用thrombin消化，先直接elute下来，跑电泳看
是不是有量比较大的杂带存在。
NaCl, |
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w*********7
发帖数: 20 | 36 你是医学院或者医院的（cardiology)人吗？问他们要点就是了。或者你周围有做血小
板的实验室吗？这种实验室一般都大量有。 |
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u******r
发帖数: 1541 | 37 用不纯的酶可能有问题，切割特异性会很差
自己recombinant生产酶，犯不着吧，还挺麻烦的 |
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u*******s
发帖数: 688 | 38 warfarin用的比较久，医学界对它的Profile都了解的比较透彻。降低血块形成的可能
，有效降低中风的风险。当然这也意味着它的主要副作用是增加出血风险。此外，吃
warfarin的病人的饮食要很讲究（avoid leafy greens)，有一些药物之间的反应，病
人还要经常monitor inr比较麻烦。
你说你父亲已经使用warfarin2年多，inr在target内，也没有什么不适（有没有仔细
monitor bleeding signs?），应该来说是manage的比较好的病人。
Dabigatran/Apixaban/Rivaroxaban是近年来出的新药。Dabigatran是direct thrombin
inhibitor, 后两个是factor 10a inhibitor。这些药的主要特性就是不需要频繁
Monitor inr，也降低了出血风险（跟剂量有关），而且还对预防中风更有效（或者non
-inferior)。价格自然也贵。
你父亲医生想给他换apixaban，有一个trial叫ARISTOTLE,评价这个药和warfarin在
afib病人中预防中风的优... 阅读全帖 |
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l********o
发帖数: 41 | 39 非常感谢您详细的回答。解除了我心中很多疑惑。 我爸也就是正常饮食，偶尔吃点青
菜，目前是没有观察到bleeding signs. 所以我有些纠结有没有必要换。尤其是看到
apixaban没有antidote.......
医生当时是说可以考虑换，但也没有强烈推荐。让我们先check一下保险包不包，我自
己多想了些。呵呵
再次感谢你，包子奉上
thrombin
non |
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h*******e
发帖数: 68 | 40 ☆─────────────────────────────────────☆
Thrombin (杀人不眨眼) 于 (Fri Aug 18 22:45:36 2006) 提到:
linear regression, Time series and forecasting, bioinformatics(microarray)哪
个对去药厂有用，哪个对去银行保险业有用？
☆─────────────────────────────────────☆
tianxin (田欣) 于 (Mon Aug 21 16:35:50 2006) 提到:
As a people learn statistics ,you should ask this question to yourself, if
you want to test something, do you need to run a DOE? In banking industry,
you need to test your product, then you need to run DOE.
industry? |
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I****a
发帖数: 407 | 41 You are right. I fully agree with coumadin的低价和可逆性还是不可取代的. This
is a medication that almost has no other side effects except bleeding risk
that can be prevented with patient's compliance and physician's vigilance.
Coumadin is a very successful drug because we can tell whether our patients
are compliance or not and most of healthy care places have the military
like mentality to deal with over or under dosing. Imagining if coumadin
patients switch to oral direct thrombin inhibitor. How are we goin... 阅读全帖 |
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m********4
发帖数: 607 | 42 Afib is one of major risk factors to cause stroke. It is common to see pts
with afib in both hospital and clinic. How to manage pts with afib w/o
stroke?
*Thank eastlake to contribute Anticoagulation question.
http://www.mitbbs.com/article_t/Medicalpractice/31165.html
I would recommend the following paper to read.
* A new landscape for stroke prevention in atrial fibrillation: focus on new
anticoagulants, antiarrhythmic drugs, and devices.
Stroke. 2011 Nov;42(11):3316-22. Epub 2011 Oct 13.
A... 阅读全帖 |
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n*****j
发帖数: 261 | 43 【 以下文字转载自 NextGeneration 讨论区 】
发信人: wwwjobs (minimouse), 信区: NextGeneration
标 题: 求助: 6个月大婴儿肝衰竭 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Apr 12 07:11:51 2013, 美东)
发信人: wwwjobs (minimouse), 信区: Medicine
标 题: 求助: 6个月大婴儿肝衰竭
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Apr 12 05:39:14 2013, 美东)
我慢慢发细节，版主请帮助置顶几天。
宝宝生下来很健康。因为母乳不够，差不多1周大的时候全部营养来自于奶粉。开始几
天similac液体奶，很快就全部是enf的固体奶粉，milk-based.这时候一切正常。除了
，非常容易吐奶，需要很多关心外，吃和拉还行。
还行就是按照医生的说法，其实我们一直觉得孩子把把有些太软。1个多月后，孩子重
量还行，闹得更厉害，吐奶更频繁，于是我们改用sensitive的配方奶粉。孩子清况好
了不少，体重及各方面数据都正常。
3个月前后，孩子的把把开始很稀了，次数更... 阅读全帖 |
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t******9
发帖数: 270 | 44 不知道你是否需要把下面的翻译成中文，试着翻译了一下。
infection 感染
metabolic disease 代谢性疾病
obstruction 梗阻（这里可能指胆道梗阻）
oncologic 肿瘤
autoimmune 自身免疫性疾病
neurologic status.. 神经系统状态
4/9 22:10
rdw 19.0h 红细胞分布宽度
monocytes, abs 2970h 单核细胞绝对数
bands,abs 1080h 不成熟白细胞绝对数
abs neutrophil ct cal 20250h 中性粒细胞绝对数
polys,% 71h 中性粒细胞百分比
monocytes,% 11h 单核细胞百分比
raw reticulocyte count 5.73h 网织红细胞计数百分比
hct corrected retic count 3.9h 根据血容量而修正的网织红细胞计数百分比
sodium level 134L 血钠水平
phosphorus serum 3.4L 血磷水平
white blood cell count 27h 白细胞... 阅读全帖 |
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