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g*********r
发帖数: 9366 | 2 Ni-column buffer 加BME， 管里加DTT，不可能交联 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 3 多谢！不过我的问题其实不是是否能够用PFA，dextran、DiI和CM-DiI都有可以用PFA的
种类。但是我的实验中甲醛固定是在切片之后，因为切片时会把切开一部分细胞，而在
甲醛固定之前染料是不会和组织交联的，所以水溶性的染料比如dextran在固定的时候
就被洗掉了。
这个FluoroGold我看了一下也是水溶性的，不知道会不会也有这个问题…… |
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j****x
发帖数: 1704 | 4 一般公司都可以提供rational antigen design的服务，从序列中特征性选取多肽片段
然后交联到BSA等载体蛋白上再制备单抗或多抗。如果目标蛋白是有三级结构信息的，
这种表位预测+多肽免疫的成功率很高，一般在70%-80%以上。即便没有高级结构信息，
有经验的设计分析人员也可以将成功率控制在50%左右，一般而言选取2-3条多肽序列就
能至少有一个能制备出不错的抗体。我们这里有core facility专门提供这种服务，这
个技术本身应该说很成熟了。
自己原核表达纯化蛋白的部分片段自然也是一个选择，以前大部分人都不纯化而只是切
胶直接免疫，取决于你要做什么样的staining了，要求抗体特异性好的，就不建议这么
做了，光做western的话还凑合。 |
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k****o
发帖数: 589 | 5 最近几天用Pierce的Seize X Protein A kit做IP，要沉淀的是一个膜受体。用的抗体
（兔IgG）应该没有问题，因为做WB和flow cytometry都成功。使用了DSS让抗体和
Protein A交联。用了300～400 ug total protein沉淀，4度翻转过夜。之后清洗用的
是自己照着kit说明配的PBS,用kit自带酸性elution buffer洗脱，收集了3个组分。可
是之后用SDS-PAGE+WB检测，受体的带完全没有。我知道这个受体肯定是表达的。请问
可能原因有哪些？
另外Seize X的kit刚好用完，有没有什么其他的kit便宜质量又不错的？曾经考虑过
dynabeads，但是貌似还得另买一台磁力沉淀器？
多谢！ |
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V********n
发帖数: 305 | 6 仅供参考。
可能出的状况
1）不理解为什么要用DSS？交联后抗体是否还有活性需要检测。
2）elution buffer是否能洗脱目标蛋白？建议直接加上样buffer。
3）细胞裂解条件是否合适，IP时的buffer条件是否合适？做IP的细胞裂解条件是否和
之前WB检测时的一致。膜蛋白可能需要比较强烈的buffer条件。但同时，IP的buffer条
件可能不能太极端，需要摸条件。 |
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k****o
发帖数: 589 | 7
用DSS是为了让抗体不被洗脱，以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性，pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer，用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗？这样即使洗脱，agarose beads也无法重
复用了吧？ |
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V********n
发帖数: 305 | 8 个人建议。不要光想着省试剂钱，你的时间也很值钱的。不如用最优化的条件做一遍，
得到正结果后再改进来省银子。几点你可能需要注意。
１）SC的抗体很多不靠谱。当然，也有好的。
２）最好不要用DSS。蛋白交联情况和处理时间有关，结果无法用其他实验验证。如果
是这一步的问题，你都无从查找。
３）低PH洗脱液可以从Agarose上洗脱抗体，但是否能保证打开蛋白－抗体的结合未知
，与多种因素相关。
４）你IP时的缓冲体系是什么，不会是１XCS的裂解液吧。
５）你蛋白上样太少了。直接加小体积上样Buffer煮，全上了做WB。
６）膜蛋白IP不好做。 |
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M******s
发帖数: 138 | 9 谢包子，
关于脱片的问题，很多人都有这个问题，fisher的superfrost一般来讲是没有问题，但
质量不是很稳定，不同批号差异挺大的，有时候会掉得一张不剩，尤其是蓝盒的问题非
常多，白盒的要好一些。我们现在都用自己的产品，基本不会有这种问题 https://www
.hitobiotec.com/product_info.php/hito-super-safe-slide-100-place-
slide-box-p
-50? 如果愿意，你可以试一试。 另外你可以试着切薄片，15微米左右，一般来讲薄片要好一些
关于脂肪滴的问题，以前有人要看脂肪或脂质体，所以脂肪必须留在原位，我给出的
protocol是针对这个目的的，现在想想你不是看脂肪，所以可以换个方法试试。（都是
不固定组织）
方法1
直接用OCT干冰包埋，切片，air dry, xylene 5min, 100% Ethanol 3min x2, 95%
Ethanol 3min x2,70%Ethanol 3min x2,D-water 1min x3,PBS 1min,水性封片剂或
甘油
封片，去看荧光
这个proto... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 10 现在通常用的固定基本只有PFA和glut两种。
前者是可逆交联，并且在组织内移动速度快。后者铰链度更大，并且不可逆，固定得更
好。但是移动速度更慢。而且对抗体保存不够好。现在一般采用混合固定，4%PFA加0.5
%的glut。
如果是大的组织，先初步固定之后，再slice成小块继续固定。
如果是免疫荧光，glut的浓度应当低于0.5% |
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b******s
发帖数: 1089 | 11 固定剂的选择应当跟你的实验目的结合。methonal会使得蛋白变性而PFA只是可逆性得
交联蛋白。GFP变性了当然就看不到荧光了。用抗体应该还是可以看到荧光的，但是作
为细胞内蛋白的定位，还是应当用PFA。methonal对整个细胞的extraction太大，而且
会使核酸和蛋白发生聚集沉淀。
可能会有artifacts。所以ethonal和methonal只适用于组织形态学的实验。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 12 sigma M2 很好啊。
sigma还有个M2 agarose，交联好的，我们实验室在用这个。 |
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C********4
发帖数: 308 | 13 不能
因为考染液里面的甲醇乙酸把蛋白交联在胶里面了
western |
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c******d
发帖数: 647 | 16 second this,cisplatin就是起交联作用，重要的作用对象就是DNA
这种药物作用很强，12uM,48小时，到底细胞死了多少呀，
我觉得恐怕没多少剩下了，用过2uM处理48小时，细胞没剩多少，但actin作为loading
control没啥变化
trade
to
class
binding |
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t******y
发帖数: 716 | 17 预测一下，与智力相关的基因会是哪些基因？
1）头骨发育? 增加头骨容量的基因?
2) 神经交联? 促进神经信号传导和处理?
3) 记忆相关? 帮助记忆形成？
还有哪些？ |
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t******y
发帖数: 716 | 18 预测一下，与智力相关的基因会是哪些基因？
1）头骨发育? 增加头骨容量的基因?
2) 神经交联? 促进神经信号传导和处理?
3) 记忆相关? 帮助记忆形成？
还有哪些？ |
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b*****n
发帖数: 1841 | 19 没有做retrieval。fix过度后抗原不暴露或者交联过度，然后retieval以后就可以了？ |
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M********r
发帖数: 142 | 20 那就是DNA提纯失败了。
直接用Qiagen的PCR purification kit就行。
带着beads一起解交联，然后当作普通的PCR产物纯化的步骤。beads堆在column里面没
事的，不影响 |
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M********r
发帖数: 142 | 21 Paraformaldehyde PFA交联之后保存？ |
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e********r
发帖数: 147 | 22 最近我们体外实验发现一个蛋白同时存在monomer和trimer形式，有意思的是，monomer
状态下，能够结合另一个蛋白，激活下游基因的表达。
现在想在体内in vivo检查一下不同刺激条件下，monomer和trimer之间比率的变化。以
前没做过类似的工作，请问应该肿么搞？刺激前后把蛋白交联起来，然后跑SDS-PAGE,
Western blotting这样的方法可行不？非常感谢。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 23 稳定是相对的，降解不全是肽键水解。氧化，交联，异构化，光降解等蛋白降解途径无
处不在。西方杂交特别敏感，很容易产生misleading的数据。
同意胖头鱼的做法，处理完就立即跑胶，否则液氮加低温冰箱保存。 |
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k*****n
发帖数: 323 | 24 蛋白的量都不是问题，只要scale够。不好搞的是交联后的蛋白就是mess，不好打质谱
。如果预期可能有几个什么蛋白，拉下来做wb到可以。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 25 先打个质谱看看蛋白质量如何。
目标蛋白和U蛋白的交联反应还要竞争ubiquitin分子间反应，知道反应速度比吗？
提高pH，可以提高二流键的形成反应速度。 |
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p*********3
发帖数: 44 | 27 如果形成二硫键的两条支链中有一条比较短，比如五个氨基酸，可以将二硫键加上这条
支链的质量看成在另一条支链上的半胱氨酸的PTM，再用一些软件去搜索，我用的是
PEAKS7.5.还有一些专门搜索带交联的肽段的质谱分析软件，比如xQuest/xProphet和
pFind studio，我没有用过，不好评论。 |
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S**********e
发帖数: 620 | 28 在理想的状态下，也就是煲汤熬到骨头烂掉的时候，基本上就是悬浊液，营养都在悬浊
液里，营养成分都到肚子里了，可能有些蛋白变性的区别而已。
我们日常吃的肉都是肌肉组织，富含肌红蛋白，但是在正常的熬汤就是把肉里的部分氨
基酸电解液弄到汤里导致汤好喝肉难吃，细胞是死掉了，但是没有SDS，NP40，triton
等，detergent的情况下，我认为交联的肌肉蛋白质是非常难能溶解的，所以其实营养
大部分还在肉里，也就是蛋白质，主要是肌红蛋白一类的。熬汤有营养根本没有任何依
据。传统文化细细追究好多都是糟粕。。。当然你要是熬汤的时候加点洗衣服就不好说
了。
其实汤喝多了往往盐含量摄入就大，因为你要有一定的咸味才入口，体积大了自然盐就
多，非常不健康。家里人喝汤，我都劝不来，糟粕深入人心。。。 |
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v*****t
发帖数: 1128 | 29 最近在重复mit大牛bawendi组里DHLA-PEG的合成，看上去很简单的一步反应，把lipoic
acid 和PEG(4 units)通过DCC，DMAP连接到一起。可是在我蒸发（30度旋转蒸发仪）
掉溶剂之后，产物居然成了胶状，并且重新加入溶剂之后不再溶解了。似乎是蒸溶剂的
时候出现铰链
可是看不出来有什么交联的可能啊，希望版上有机专家指点一二。 |
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h*****e
发帖数: 1330 | 32 已经酸解成氨基酸了，再PITC衍生， 然后HPLC，接着MS（用MALDI/NALDI-TOF），感觉
测不出来 |
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W*******R
发帖数: 1224 | 33 PITC对氨基的衍生物在酸性下很不稳定，你过柱子柱子如果是硅胶柱等弱酸性物质，你
当然什么都拿不到。好好看看edman降解是怎么回事，机理要搞懂。 |
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s*****e
发帖数: 172 | 34 谢谢。如果真空的话，需要非常精密的真空箱吗？
我还看过文献报道：如果这样的膜被UV光照，PS会交联，PMMA会裂解。而且有的报道说
要在惰性气体里面UV光照，比如Ar气。如果不用惰性气体，又会如何呢？
谢谢。 |
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r******0
发帖数: 2753 | 35 这么粗浅的问题还想难倒我们？切！
这个高分子应该是一个copolymer，结构比较复杂，我们测量了它在各种溶剂中的溶解度，发现都不太好（换了好几种溶剂都没把瓶子洗干净），估计有一定程度的交联，所以表征比较困难。最后我们把工作的重点转移到monomers的官能团活性上，希望能从这方面的研究来推测和验证形成的高分子的结构，我们做了......（哈，回到小分子反应了吧）。我们还发现另一个结构相似的monomer也能生成类似的copolymer......（NND，又做砸了一锅）。
刚才忘了说性质，我们认为这种高分子在粘接剂应用上会有很大的潜力，它不但在极性表面上有很好的粘性（粘在玻璃瓶上洗不下来），而且对非极性表面如塑料（洗瓶子的时候，试管刷上也粘了不少），金属表面如不锈钢（小药铲上也粘了不少）都表现了很好的粘性。对于它能在各种不同的表面都产生很好的粘着性的机理，我们还在进一步的研究中。 |
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j*********5
发帖数: 6221 | 37 我菜鸟啊，哈哈，给你说我不懂高分子啦，交联机制是啥？哈哈 |
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S*****n
发帖数: 6055 | 38 发回信箱好好学习。。。
解度，发现都不太好（换了好几种溶剂都没把瓶子洗干净），估计有一定程度的交联，
所以表征比较困难。最后我们把工作的重点转移到monomers的官能团活性上，希望能从
这方面的研究来推测和验
会有很大的潜力，它不但在极性表面上有很好的粘性（粘在玻璃瓶上洗不下来），而且
对非极性表面如塑料（洗瓶子的时候，试管刷上也粘了不少），金属表面如不锈钢（小
药铲上也粘了不少）都表现了很好的粘性。对于它能在各 |
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J******s
发帖数: 377 | 39 呵呵，交联了也可以show个GPC呀，就是峰出来晚点罢了 |
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j*****n
发帖数: 26 | 40 哇塞！！！！！！！！！！！！！！！
膜拜啊～～神啊～～～
比起罗斯同学
偶的书都算是白读了
解度，发现都不太好（换了好几种溶剂都没把瓶子洗干净），估计有一定程度的交联，
所以表征比较困难。最后我们把工作的重点转移到monomers的官能团活性上，希望能从
这方面的研究来推测和验证形成的高分子的结构，我们做了......（哈，回到小分子反
应了吧）。我们还发现另一个结构相似的monomer也能生成类似的copolymer......（
NND，又做砸了一锅）。
性表面上有很好的粘性（粘在玻璃瓶上洗不下来），而且对非极性表面如塑料（洗瓶子
的时候，试管刷上也粘了不少），金属表面如不锈钢（小药铲上也粘了不少）都表现了
很好的粘性。对于它能在各种不同的表面都产生很好的粘着性的机理，我们还在进一步
的研究中。 |
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t*****3
发帖数: 586 | 42 现在在做一种水凝胶，是用高分子上的氨基和醛基形成Schiff base凝聚， 但想检查一
下交联度，个人认为的是测量凝聚中氨基或者醛基的减小量，或者Imine的增加量来确
定，但不知道有什么仪器可以定量检测这些官能团，不知道大家有什么建议，知道什么
仪器可以检查吗？ |
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p******h
发帖数: 68 | 44 太厉害了。
本来有氨基或者巯基，可以买试剂盒交联。但是这个结构没有，就没其他法子了。
你是怎么知道这个有荧光的？用酶标仪能读出来么？ |
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k***g
发帖数: 4904 | 45 有啥简单的和通用的解释么有？比如做内胎的丁基橡胶等等，气密性特好，可是硅橡胶
往往透气性特强，同样看起来都软软的，有弹性，为啥差别这么大？尤其是气密性橡胶
，拉伸很大比例后还不透气，是什么原因呢？不能简单从交联度解释吧？这还可以扩展
到塑料，为啥有的透气有的不透呢？ |
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p******s
发帖数: 193 | 47 想照着2009年邓春晖Angew chemie的Fe3O4@SiO2@PMMA 的文章，做这个东西，用来接功
能蛋白
大家看看，最后的聚合不需要引发剂么？
前文不赘述了，Fe3O4@SiO2-MPS 已经合成好了
要往上面修饰PMMA了，
The sandwich structured Fe3O4@SiO2@PMMA microspheres were synthesized via an
aqueous-phase radical polymerization. Typically, in a three-necked round
bottom flask (100 mL) equipped with a mechanical stirrer, a refluxing
condenser, and a nitrogen inlet, 10 mL of ethanol dispersion of Fe3O4@SiO2-
MPS microspheres were mixed
with 50 mL of aqueous solution containing 5.0 mg of ... 阅读全帖 |
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f**********r
发帖数: 18251 | 48 EDC效率太低，直接5摩尔倍酰氯反应，还是用冷冻乙醚（温度低点）提纯几次好了
如果做交联的话，没必要非常纯；如果你要做希弗加成的话，多提几次或者直接买好成
品好了 |
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z***x
发帖数: 9 | 49 讨论一下这个吧， 做了一个高分子， 但不知道是不是交联的， 找不到溶剂可溶它， 这
应该算是一个证据吧， 可老板说这不够， 不知道还有什么方法可以表征。
谢了。 |
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