m******5
发帖数: 1383 | 1 实验室的protocol比较简单，做的都是类似Smad 1，5，8之类的表达量高的蛋白
最近working on一个endogenous tageted的蛋白，虽然用的是标签抗体，但仍然没做出
来，过来求一个protocol |
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l*h
发帖数: 4124 | 2 probably no need for a whole new protocol, but pay attention to the
following:
1. use a high-affinity antibody
2. use a more sensitive detection system
3. try different methods and depths of fixation
4. make sure the pH values of your buffers are in the recommended range. |
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m******5
发帖数: 1383 | 3 how am I supposed to know which kind of antibody is 'high affinity' antibody
? which kind of detection system would be more sensitive? |
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l*h
发帖数: 4124 | 4 enzymatic chemiluminescent systems are typically a lot more sensitive than
fluorescent probes. it depends on your application whether a certain
detection system can be effectively used.
for antibodies, you can talk to tech support first and then ask around.
antibody |
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f***4
发帖数: 886 | 5 很多短肽标签如果在单倍情况下（没有重复多次这个标签），在冰冻切片下作IHC效果
不好。
查查文献，难道别人没有用内源性蛋白的抗体做过IHC？ |
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M*****n
发帖数: 16729 | 6 IHC这东西基本上就是靠抗体
抗体好，民工也能做出来，
抗体不好，那就苦了。 |
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f***4
发帖数: 886 | 7 欧们本来就是民工啊？
抗体这玩意儿，条件多的是，固定剂，固定时间，干湿情况。。。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 9 非常感谢你的提示
根据你的提示读了很多文章，得知GU rich sequence确实对于其process必不可少
但是又有一个很大的疑问：很多内源的polyA signal并不含有GU rich sequence，只有
AATAAA这个conserved motif，下游是一堆随机碱基，请问这种情况下polyA加尾是如何
实现的呢？
这是一个有共识的问题么？或者只是一个伪命题？ |
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y*********u
发帖数: 183 | 11 that is also how I figured it, I designed such a knock in animal by
replacing the whole exon1 and exon2 (keep some flanking sequence as splicing
context) without additional polyA signal. I am hoping it would work
binding |
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y*********u
发帖数: 183 | 12 /i am waiting for feedback from people who did this!!!! |
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y*********u
发帖数: 183 | 16 有搜到文章给出这类结论，会不会增强我不管了，不知道会不会减弱上游基因表达。
这似乎很有可能，因为IRES driven translation是5'3'cap/tail结构independent的 |
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V********n
发帖数: 305 | 17 IRES的调控是translation水平上的。
还是不明白LZ的意思，如果mRNA的结构是cap-gene1-IRES-gene2-3UTR，gene1的翻译可
能被抑制，IRES一般含有stem loop高级结构，会阻碍translation elongation。如果
cap-gene1-3UTR, IRES-gene1-3UTR是两个独立的mRNA,gene1的表达不太可能被抑制，
因为IRES的翻译效率很低。
另外IRES不完全是3-tail independent。是否就完全5cap independent，我觉得也不好
讲。IRES只是说ribosom loading不需要cap（其实这个概念本身就问题多多），cap的
作用不限于ribosom entry，还包括mRNA 稳定等。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 18 gene 1 need 3'utr?
I just put two orf in pIRES plasmid... |
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c********b
发帖数: 363 | 19 Mir168a是植物特有的。动物细胞就是破裂也不会有这个。
动物内mirna细胞间运输是通过exosome 或脂肪体.植物内细胞间rna运输或者植物间遗
传物质运输很常见.动物血清内mirna被作为癌变marker现在也起步了。好像脂肪体运输
的还可以起到特异输送到某个靶目标的功能。
我还没读原文.如果真是内源水平上调控而不仅仅是reporter系统的话，怎么都该启码
是nature 子刊级别的。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 20 其实应该说这个并不奇怪，之前有计算表明，每一个human miRNA都可能参与调控多个
靶点，而且数目还不小（有人认为可能平均下来可能会有上百个，不过争议比较大），
原因可能在于miRNA/mRNA interaction对序列匹配度的要求至少目前看来不是特别的高
，考虑到transcriptome这么大，那么无论内源外源的miRNA能蒙上几个target应该说并
不意外，碰巧又有相关的生物/生理学功能，那自然就会吸引眼球了。 |
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c********b
发帖数: 363 | 21 Mir168a是植物特有的。动物细胞就是破裂也不会有这个。
动物内mirna细胞间运输是通过exosome 或脂肪体.植物内细胞间rna运输或者植物间遗
传物质运输很常见.动物血清内mirna被作为癌变marker现在也起步了。好像脂肪体运输
的还可以起到特异输送到某个靶目标的功能。
我还没读原文.如果真是内源水平上调控而不仅仅是reporter系统的话，怎么都该启码
是nature 子刊级别的。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 22 其实应该说这个并不奇怪，之前有计算表明，每一个human miRNA都可能参与调控多个
靶点，而且数目还不小（有人认为可能平均下来可能会有上百个，不过争议比较大），
原因可能在于miRNA/mRNA interaction对序列匹配度的要求至少目前看来不是特别的高
，考虑到transcriptome这么大，那么无论内源外源的miRNA能蒙上几个target应该说并
不意外，碰巧又有相关的生物/生理学功能，那自然就会吸引眼球了。 |
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s**a
发帖数: 293 | 23 也许内源表达太低测不到……全细胞裂解液的 positive control 有没有条带？
没的话换用高灵敏度的发光底物试试
1ug |
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u**********d
发帖数: 573 | 25 如果是内源蛋白的话，阴性对照需要有两种，一个是用normal IgG，一个是没有转录因
子结合的区域也设计一对引物来扩增。有显著差异就可以了。如果是前一个对照不好，
可能是input里有大的凝聚物没有离心分离干净，也可能是beads没有封闭好，试着预清
除。把功课做好，让老板找不出茬，他再骂，炒了他！此处不留爷自由留爷处。 |
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R*****o
发帖数: 12 | 26 表达蛋白和peptide没啥大的区别，文献中报道利用蛋白做抗原最后产生的也是1-2个优
势表位且以线性表位为主。不过peptide最大的问题应该是预测的线性表位是否准确的
问题，所以要是做一条肽的话成功率会很难保证，很可能Elisa识别peptide很好但是不
能识别内源。不过如果预测好一点或者多选择几条的话，应该还是不错的。
另外有的公司也提供可溶表达的服务，比如上面说的Abmart，可以利用可溶表达蛋白和
多肽两种方法同时做。 |
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u**********d
发帖数: 573 | 27 我自己M2做IP、IF、ChIP都挺好的。你会不会是用的量太多了？
有个日本人叫Minoru在NIH，他组里做了很多整合FLAG标签到内源蛋白的细胞系，用来
做ChIP的，你要不查查他们的文献用的啥抗体。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 28 您的试验说明了：
1。 GFP抗体优于actin的抗体。同样的蛋白量，GFP抗体可以轻易监测到，而用actin抗
体比较费劲测定。
2。内源的actin表达量远高于GFP－actin的表达量。所以用actin抗体可以容易检测到
43kDa
的蛋白带，而较难检测到70kDa的带。
即使尝试其它办法，可能也是得出同样的结论。 |
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k****z
发帖数: 1863 | 29 方舟子：实际上目前的检测方法不可靠
大嘴韩乔生 加关注
@叶诗文 用勤奋和汗水铸就的两枚伦敦奥林匹克游泳金牌的辉煌，是西方媒体中那些别
有用心的人抹杀不了的，欧美许多有名的运动员都对小叶挑起大拇指称赞。而国内有些
自以为专家、学者的人这时抛出这样的东西，我看他心眼长歪了。其言论更经不起推敲
。我们会用事实来回击的。
◆◆@方舟子： 1998年1月中国女游泳运动员原媛和教练周哲文去澳大利亚珀斯参加世
界游泳锦标赛，被澳大利亚海关查出携带了13瓶生长激素。这很倒霉，因为外源生长激
素与内源的一样，它的使用很难查。世界反兴奋剂机构认为通过血检能检测出运动员使
用生长激素，也有过被检测出的个别例子。实际上目前的检测方法不可靠。 转发(4805
) | 评论(3798) 8月2日 22:55 来自新浪微博 |
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M*P
发帖数: 6456 | 30 转基因要看转什么。
抗虫的棉花转的是BT毒素，如果是转倒吃的里面，我也反对。
抗除草剂的大豆，据我所知，转的是一个酶的点突变，你平时吃的任何一种蔬菜里面的
突变都比那个点突变多一万倍，我看没什么问题。
golden rice属于转了一个通路，要是用内源基因的话，只是改变了基因表达的位置，
出问题的可能也很小。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb - 中文网站浏览器 |
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C******8
发帖数: 136 | 31
能问一下为什么吗？ 我只坐过ChIP,还没做过ChIP-seq,只知道要用特定的kit
那种kit比较好？
此外，如果用内源表达的加了tag的gene, 用anti-tag的抗体，应该会好做一点吗？ |
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t****p
发帖数: 1504 | 32 引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳定的资助，那
么类似的科学突破就会随机但是必然地产生。从这种意义上讲，展示Shinya Yamanaka
在研究过程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是值得我花
一点时间的。
解析Shinya Yamanaka发现诱导干细胞（iPS... 阅读全帖 |
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t****p
发帖数: 1504 | 33 引言
山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后
我兴致很高地写了两篇文章，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的
工作。
我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项
目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目
真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得
这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着
。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础
研究有什么用。
Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有
相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳定的资助，那
么类似的科学突破就会随机但是必然地产生。从这种意义上讲，展示Shinya Yamanaka
在研究过程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是值得我花
一点时间的。
解析Shinya Yamanaka发现诱导干细胞（iPS... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 34 另外你说得不work是什么意思？
我们所有genotype都有内源control，也就是说无论老鼠是否tg，都有一条带确定PCR是
work的，tg老鼠再在tg大小位置上多一条带。
这样我们遇到酒精问题的时候才马上就确定是这一批样品都有问题。
另外你为啥要把vector跟wt genomic dna混起来，为啥不直接用转基因小鼠。
hour |
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b******n
发帖数: 4225 | 35 1 Science 2 Cell papers:
Devireddy LR, Teodoro JG, Richard FA, Green MR (2001) Induction of
apoptosis by a secreted lipocalin that is transcriptionally regulated by IL-
3deprivation. Science 293: 829–834.
Devireddy LR, Gazin C, Zhu X, Green MR (2005) A cell-surface receptor for
lipocalin 24p3 selectively mediates apoptosis and iron uptake. Cell 123:
1293–1305.
Devireddy, L. R., D. O. Hart, D. H. Goetz & M. R. Green, (2010) A mammalian
siderophore synthesized by an enzyme with a bacterial homolog... 阅读全帖 |
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b******n
发帖数: 4225 | 36 1 Science 2 Cell papers:
Devireddy LR, Teodoro JG, Richard FA, Green MR (2001) Induction of
apoptosis by a secreted lipocalin that is transcriptionally regulated by IL-
3deprivation. Science 293: 829–834.
Devireddy LR, Gazin C, Zhu X, Green MR (2005) A cell-surface receptor for
lipocalin 24p3 selectively mediates apoptosis and iron uptake. Cell 123:
1293–1305.
Devireddy, L. R., D. O. Hart, D. H. Goetz & M. R. Green, (2010) A mammalian
siderophore synthesized by an enzyme with a bacterial homolog... 阅读全帖 |
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t****b
发帖数: 47 | 37 2012年11月13日，新的生物学刊物eLife发表论文：中国科学家攻克了一个长期困扰国
际科学界的难题，而这一基础科学问题也与人类、特别是中国人民的健康相关。
过去，世界和中国忽略了1980年代我国科学家在条件艰苦时代做出重要贡献，我们现在
应该赞广西肿瘤防治研究所的严瑞琪和苏建家等、北京第二传染病院的余昌晏等和中国
医学科学院的庞其方等建立乙肝动物模型；
现在，我国已经有条件和能力改革科学管理体制机制、提供适当环境，让一些科研机构
年富力强的科学家心无旁骛，如北京生命科学研究所的李文辉带领学生和同事发现乙肝
病毒受体；
将来，希望全国科研机构能推广适合各个学科和机构自身规律的体制机制改革，使大批
年轻人集中精力在专业上充分发挥作用，他们大有作为才能使中国的科学大有希望。
肝炎和肝炎病毒
肝炎在全世界有广泛的危害，中国人群肝炎患病率尤其高。多种病毒导致病毒性肝炎：
甲、乙、丙、丁、戊（A、B、C、D、E）等。
全球二十亿人曾感染乙型肝炎病毒（HBV），慢性乙肝感染超过3.5亿人。即使在乙肝疫
苗已经研制成功多年以后，我国还有逾九千万人感染过乙肝病毒，上千万乙肝患者，每
年感染超过百万... 阅读全帖 |
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f**u
发帖数: 346 | 38 我记得在哺乳细胞里面已经做到用GFP去tag内源蛋白了，
忘了是ZFN还是TALEN了，不过应该差不太多吧。
其他物种好像还没看到。 |
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f**u
发帖数: 346 | 39 我记得在哺乳细胞里面已经做到用GFP去tag内源蛋白了，
忘了是ZFN还是TALEN了，不过应该差不太多吧。
其他物种好像还没看到。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 40 即，不转染Ub，内源蛋白WB就既可以看到被ubiquitination条带。
有没有这样的例子？
好像sumo化也是这样，paper上一般都是过表达Ub或SUMO后，再看ubiquitination和
sumoylation强度 |
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a**********u
发帖数: 28450 | 41 【 以下文字转载自 WaterWorld 讨论区 】
发信人: monolith (on the road), 信区: WaterWorld
标 题: [请转生物版（第一天注册，只能发水版)问题急求] IP 问题，各位大牛请进
关键字: 生物版 IP问题
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Apr 24 10:56:49 2013, 美东)
做一个Co-IP实验，检测骨架蛋白plectin(>500KD)与一个GTPase（A）的相互作用。内
源plectin,高表达A(A-flag)或 dominant negative A (DN-A-flag)。用plectin单抗做
IP，anti-flag blot 显示A-flag可以被co-IP下来，同样的co-IP GFP-negative
control 背景比较干净，而co-IP DN-A-flag有微弱信号（约为A-flag 的1/10）。
用做IP同样的antibody blot plectin,input 部分一切正常，显示相同的内源plectin;
问题出在 straight IP部分，同样的抗体同时blot同一块胶上... 阅读全帖 |
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t******n
发帖数: 2939 | 42 【 以下文字转载自 WaterWorld 讨论区 】
发信人: monolith (on the road), 信区: WaterWorld
标 题: [请转生物版（第一天注册，只能发水版)问题急求] IP 问题，各位大牛请进
关键字: 生物版 IP问题
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Apr 24 10:56:49 2013, 美东)
做一个Co-IP实验，检测骨架蛋白plectin(>500KD)与一个GTPase（A）的相互作用。内
源plectin,高表达A(A-flag)或 dominant negative A (DN-A-flag)。用plectin单抗做
IP，anti-flag blot 显示A-flag可以被co-IP下来，同样的co-IP GFP-negative
control 背景比较干净，而co-IP DN-A-flag有微弱信号（约为A-flag 的1/10）。
用做IP同样的antibody blot plectin,input 部分一切正常，显示相同的内源plectin;
问题出在 straight IP部分，同样的抗体同时blot同一块胶上... 阅读全帖 |
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a*****n
发帖数: 2835 | 43 解冻以后的细胞再做一个RT-PCR看看
另外确认一下抗体能识别内源的蛋白 |
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d****i
发帖数: 2346 | 45
按照碱基的长度看的话确实是CRISPR稍微差一点。我主要是看了Qi的那篇cell文章，他
们用了RFP作为target，也可能是RFP在细菌和细胞内本身就是一个外源基因，内源
genomic DNA里面同源的序列比较少或没有，，因此看起来特异性就高了很多。 |
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m***7
发帖数: 62 | 46 我的目的蛋白内源表达太弱,很难检测到。希望能在不改变表达特异性的基础上，提高
蛋白的表达量。
请问有什么比较通用的方法么？尤其可以用到老鼠身上做knockin的。
谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 47 如果内源蛋白也有高度泛素化的话那会很有意思。如果仅仅是转进去的蛋白有这种现象
的话就比较难说了。
至于说高度泛素化的蛋白，histone protein 和一些结构蛋白是可以出现的。因为它们
会被固定在相关的细胞结构上所以不会很快被降解。但是那些蛋白一般只会出现少于４
个ubiquitin的修饰。很少听说会出现多泛素化的。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 48 要我猜就是
1）灵敏度的问题。
有时候，目标蛋白的抗体灵敏度高很多。多上点样，增加暴光时间或者多加DNA，增加
表达。
2）检测到的目标蛋白是内源的。你的Plasmid并没有表达。
Flag |
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l*********2
发帖数: 247 | 49 目标蛋白不是内源的，在293T里不表达。我用六孔板转染的，每孔转了1ug质粒。只能
多上样或者先做immunoprecipitation浓缩后再做western了。谢谢！ |
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l*********2
发帖数: 247 | 50 negative control已经做了，的确是没有内源表达。
订了sigma的control protein，准备做positive control证明抗体ok。
我用了thermo的protease inhibitor。只能再试试了。谢谢！
lysate |
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