h******u
发帖数: 131 | 1 分子生物学技术“圣经”的作者 精选
已有 7001 次阅读 2011-6-8 07:55 |个人分类:科学|系统分类:观点评述|关键词:生物
技术 圣经 基因组 中国 美国
科学和《圣经》有着根本的冲突。
但有时，某些科学书籍很有权威、或非常流行，人们戏称为“圣经”，是引号
，不是书名号。
最近几十年，生物理论书籍中最权威的，可能是旧金山加州大学教授、美国科
学院前院长、现任《科学》杂志主编Bruce Alberts主编的《细胞的分子生物学》（
Molecular Biology of the Cell），五大洲学生用了二十多年。
2011年6月8日，也就是本周三的下午4点，应谢晓亮教授邀请来北大给学术报
告的Tom Maniatis教授，曾是我这一辈人做学生期间一本“圣经”的作者。
这本书为《Molecular Cloning》，是1980到1990年代分子生物学技术最常用
的手册，很多人靠此书入门学会克隆DNA。
Maniatis是1970年代几项主要分子克隆技术的发明者：第一个构建基因... 阅读全帖 |
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b********c
发帖数: 161 | 2 表达的是外源蛋白不是内在酶。多谢楼上几位的回复， 我其实就想在可溶上清里面找
到蛋白而已，因为我太怀疑全部表达蛋白都跑到inclusion body 里面去了。而且类似
的4，5个蛋白基本都在可溶上清里面提纯的出来。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 3
你这个方法也是解决问题的一个办法，不过如果表达的外源蛋白对细胞的增殖有影响的
话，最终导致细胞数不一致，所以提取的总蛋白量也不一致，这样还可以来做
normalization吗？另外你这里说的蛋白量是蛋白浓度吗？还是其他？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 4 有没有办法pcr 接入位点？pcr一个引物在基因组上，一个引物在外源序列上 |
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A*******e
发帖数: 284 | 5 我是反对转基因的，我之所以反对不是因为我对转基因技术无信心，而是我觉得就凭现
在的知识水平， 还难以凭估转基因在若干代以后的影响。万一这是个负影响，那就玩
玩了。 不要说转基因就是把外源基因加在合适载体上再插到基因组那么简单。实际上
转基因作物一旦释放到自然界，就基本上很难控制了，你今天种的抗除草剂转基因水稻
，也许若干代后那些杂草就获得抗除草剂基因了。不要相信这些作物自花授粉，种的隔
离这些。基因的交流往往出乎我们意料之外。据我了解，有很多转基因事件，就和当初
设计的完全不一样。当初设计想通过转基因提高某物的含量，结果转了以后完全不是这
回事，这证明我们对转基因后果的理解还是非常有限的。 而且这些转基因食品食用了
以后，对人体有害还是无害，这是短时间能发现得了的吗？ 转基因可以作为一种研究
基因功能的手段，在实验室里使用，但是释放到外界，是不可以的。为子孙后代记，目
光要长远！ |
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b********9
发帖数: 1061 | 6 物种内本身的突变和把其他物种的外源基因转进去还是不一样的。。。 |
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b********9
发帖数: 1061 | 7 嫁接也是两个原来亲本植物所有作物。
而现在的多数转基因外源基因，并非如此，有些来自细菌、病毒和其他生物体。 ... |
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s********n
发帖数: 2939 | 8 我也是反对转基因作物大规模推广的，其实转基因的危害可能并不是仅仅在于所转的基
因本身（比如抗除草剂蛋白和bt蛋白），还在于这些外源的蛋白在植物中表达后可能对
植物本身产生的影响(可能是好也可能是有害，或者中性)，还有就是楼上提到的基因横
向转移的可能性。 |
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x**e
发帖数: 163 | 9 忍不住说几句，我是做水稻基因克隆，也就是为水稻转基因提供基因资源的工作。首先
，大家无论是支持还是反对转基因的都认同转基因技术能够给植物带来更优良的性状，
大家争论的焦点在于安全性上。
1. 安全的相对性
安全应该是个相对的概念，这个世界上没有绝对安全的食物，即使是普通的非转基因大
米同样有人会过敏。那么我们在评价转基因水稻的安全时就应该遵循“实质等同”的原
则，既转基因水稻相对常规水稻没有更大的危害，比如说相似大小的过敏人群比例，我
们就应该能接收它，否则我们就应该抛弃所有的水稻品种，因为他们都有可能使人过敏。
2. 如何认定安全与否
安全与否肯定不能大家打嘴仗说了算，比如有的民科说的某院士子孙五代吃了没事才安
全，应该是有现有的食品安全检测技术说了算，比如说毒理实验，动物喂饲等。如果是
现有的科技水平内认证的安全，我们就应该认同它是安全的，除非你能证明有人操控了
认证。否则我们就要推翻这个食品安全检测体系下所有的食品安全认证，因为这是应当
遵循的游戏规则。其实很多反转基因的人都会说它有潜在的风险，这里的关键词是“潜
在的”。转基因的安全问题是一个全世界关注的话题，如果在... 阅读全帖 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 10 关于恩度有没有内行的评价一下啥。貌似罗永章最近几年的文章挺猛的。
作者：不平而鸣
方舟子先生：
此信是揭发今年的工程院第二轮候选院士，清华大学教授罗永章。
此人靠所谓的中国第一个抗血管生成的抑瘤生物药物-恩度沽名钓誉，并在
转让公司时赚取了上亿人民币。可惜，其所吹嘘的恩度，不过就是美国Entremed
临床未获批准的endostatin。 关于此物，您可能也是早已了解，由于其发明人
JudahFolkman在世界除了中国以外都不能证明其临床的有效性，所以即使罗永章
侵犯了其知识产权，为了获得诺贝尔奖，他还是大吹特吹中国的恩度。罗永章主
要论据就是其生产的endostatin是复性比Entremed的好（其实也就是鸡同鸭比，
一个是细菌表达，一个是酵母），其次，恩度是his-tag蛋白，在世界上可谓闻
所未闻将his-tag的蛋白作为治疗药物使用（其实也就是提纯工艺不过关而采取
的不得已而为之方法。其不说这种外源tag会增加endostatin的免疫原性，使其
半衰期降低。更可笑的是1.罗还在各个会议上大吹自己是蛋白提纯大牛；2.大肆
发表未经严谨验证的论据his-tag可以增强蛋白半衰... 阅读全帖 |
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k*****n
发帖数: 417 | 11 听清华的同学说，恩度好像确实有肿瘤抑制效果，但肿瘤迁移明显增加！不知道是不是
真的
关于恩度有没有内行的评价一下啥。貌似罗永章最近几年的文章挺猛的。
作者：不平而鸣
方舟子先生：
此信是揭发今年的工程院第二轮候选院士，清华大学教授罗永章。
此人靠所谓的中国第一个抗血管生成的抑瘤生物药物-恩度沽名钓誉，并在
转让公司时赚取了上亿人民币。可惜，其所吹嘘的恩度，不过就是美国Entremed
临床未获批准的endostatin。 关于此物，您可能也是早已了解，由于其发明人
JudahFolkman在世界除了中国以外都不能证明其临床的有效性，所以即使罗永章
侵犯了其知识产权，为了获得诺贝尔奖，他还是大吹特吹中国的恩度。罗永章主
要论据就是其生产的endostatin是复性比Entremed的好（其实也就是鸡同鸭比，
一个是细菌表达，一个是酵母），其次，恩度是his-tag蛋白，在世界上可谓闻
所未闻将his-tag的蛋白作为治疗药物使用（其实也就是提纯工艺不过关而采取
的不得已而为之方法。其不说这种外源tag会增加endostatin的免疫原性，使其
半衰期降低。更可笑的是1.罗还在各个会议上... 阅读全帖 |
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w***7
发帖数: 1637 | 12 杨有一篇一作的PNAS 文章，讲的就是如何改变水稻中蛋白表达系统来提高外源蛋白表
达水平的。 |
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p****n
发帖数: 9263 | 13 什么意思啊，你是说san diego这个城市不让在烟草中表达外源蛋白？
再说这跟气候有毛关系啊，烟草这种神器南到云南北到黑龙江都大片大片在种，怎么武
汉就不适合了？多退一万步说，就算武汉真的凶恶到烟草都不长，实验室盖不起温室吗
，做植物的实验室哪个是只在大田里育苗的？
烦。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 14 好久没看review了。为了防止那些外源基因胡乱表达，
以前有inducible的，或者是cre-loxp一类的（这个效率
多高啊？有100%吗？），现在有啥更好的方法啊？
多谢了 |
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b******3
发帖数: 377 | 15 我就是检测所有代谢物的，所以任何外源无论是细胞外代谢物还是培养基都不希望看到
。所以就在找buffer. |
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y*********u
发帖数: 183 | 17 that is also how I figured it, I designed such a knock in animal by
replacing the whole exon1 and exon2 (keep some flanking sequence as splicing
context) without additional polyA signal. I am hoping it would work
binding |
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y*********u
发帖数: 183 | 18 /i am waiting for feedback from people who did this!!!! |
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b****u
发帖数: 2771 | 19 比如 一些药用蛋白， 抗体 在血浆中 经常降解
可能是 N and C 端 有切损， 有没有相关的研究，推断出位点 和可能的 酶和
pathway. |
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j*****d
发帖数: 787 | 20 在我们默认数据属实的情况下，这个故事的逻辑链讲的很好的，不愧发在细胞研究上。
1）以小RNA（新啊，特异性又会很好）为载体的避过食道降解的或屏障的外源入侵。
２）有非常明确的人体内部系统的（人呢，重要啊）靶标和功能调节。
这不就是各大制药厂梦寐以求的短平快制药途径吗？植物药物工厂的时代，成本相当低。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb - 中文网站浏览器 |
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j*****d
发帖数: 787 | 21 我现在操心的是 细胞 怎么把外源的miRNA 内吞到胞内？分泌部分似乎解决了。以后能
够miRNA 作 ligand 就爽了。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 22 其实应该说这个并不奇怪，之前有计算表明，每一个human miRNA都可能参与调控多个
靶点，而且数目还不小（有人认为可能平均下来可能会有上百个，不过争议比较大），
原因可能在于miRNA/mRNA interaction对序列匹配度的要求至少目前看来不是特别的高
，考虑到transcriptome这么大，那么无论内源外源的miRNA能蒙上几个target应该说并
不意外，碰巧又有相关的生物/生理学功能，那自然就会吸引眼球了。 |
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j*****d
发帖数: 787 | 23 在我们默认数据属实的情况下，这个故事的逻辑链讲的很好的，不愧发在细胞研究上。
1）以小RNA（新啊，特异性又会很好）为载体的避过食道降解的或屏障的外源入侵。
２）有非常明确的人体内部系统的（人呢，重要啊）靶标和功能调节。
这不就是各大制药厂梦寐以求的短平快制药途径吗？植物药物工厂的时代，成本相当低。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb - 中文网站浏览器 |
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j*****d
发帖数: 787 | 24 我现在操心的是 细胞 怎么把外源的miRNA 内吞到胞内？分泌部分似乎解决了。以后能
够miRNA 作 ligand 就爽了。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 25 其实应该说这个并不奇怪，之前有计算表明，每一个human miRNA都可能参与调控多个
靶点，而且数目还不小（有人认为可能平均下来可能会有上百个，不过争议比较大），
原因可能在于miRNA/mRNA interaction对序列匹配度的要求至少目前看来不是特别的高
，考虑到transcriptome这么大，那么无论内源外源的miRNA能蒙上几个target应该说并
不意外，碰巧又有相关的生物/生理学功能，那自然就会吸引眼球了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 in vitro translation 无法排除外源酶的作用。因为cell extract 里面有
不少蛋白酶是除不掉的。 |
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g*****p
发帖数: 451 | 27 哦，这样的话就很合情合理了
你开始的CHO分泌型表达，蛋白在培养基里面的浓度是很低的
一般表达良好的外源蛋白在CHO中最多也就1~10 mg/L，如果你的蛋白分子量在一般范围
20~50 kD, 那蛋白酶浓度也就0.02uM或者多点，况且pH比较高，酶的活性也低，所以你
能看到很多full length的酶，E.coli表达的东西都是包涵体，活性全无，自然也就大
都是
full length了
合成多肽切割实验不是证明有其他蛋白酶能切，而是证明它自己能识别这个位点，而且
可以
把动力学参数算出来，不过这个是反式剪切实验，至于你的自切是反式切割还是顺式切割
就没办法证明了
你说的pH induced 酶自切活性是个很有趣的发现
我觉得你得查查文献把这个酶的细胞定位搞清楚
因为在endosome pH5-6,如果酶定位在这里，那跟其生理功能是非常相关的
至少我知道的一个例子是流感病毒HA，它发挥膜融合功能的时候就是可以在endosome通过
pH induced构象变化，然后进行病毒－细胞膜融合
如果你的pH导致构象变化是有意义的
那做药就至少有3种途径了
1.catalytic site... 阅读全帖 |
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b******y
发帖数: 627 | 28 "现在只能做出高表达的外源IP" suggesting C and D interacts. If your pull-down
is in stringent conditions, that data is important.
Why does C have to interact with D? For example, if C is a kinase and D is
phosphorylated by C, their interaction should be transient and barely
detectable. |
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b******n
发帖数: 4225 | 29 多大的基因啊
这种外源表达，实在不好说
?
is |
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Z******5
发帖数: 435 | 30 pll3.7通常是用来表达miRNA或者shRNA的。
最近想构建一个表达蛋白的载体，但是手上只有这套病毒系统。想问问：
1，有没有人用过这套系统表达蛋白？
2，mU6启动子应该是不能用吧，是不是要用CMV启动子，和GFP做融合表达？
3，我要表达的是一个转录因子，担心与GFP融合会影响其功能。考虑将 CMV+GFP 这段
用 CMV+外源基因+IRES+EGFP+SV40 polyA 替换掉，这样构建好的载体就有近10kb了，
会不会影响病毒包装效率？
另外再问一个我要过表达的是一个原癌基因，在安全性方面是不是要非常小心？ |
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p******b
发帖数: 379 | 31 我觉得如果这个能做出来的话市场还是很大的， 呵呵， 现在ShRNA 之类的需求太多了
，请问你蛋白水平用什么技术鉴定呢？ WESTERN BLOT吗？ 检测内源蛋白的话工作量
和成本就很大了。 可是如果是检测外源蛋白的话，能不能肯定在内源蛋白上也有相同
效果呢？
library |
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k****o
发帖数: 589 | 32 请教下sunnyday，已经synchronized的细胞受到外源刺激后，会不会发生
desynchronization？ |
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f*****n
发帖数: 12752 | 33 recombinant cho表达一个酶，如果改变表达条件（如ph，温度，养分组分等）使得
mRNA表达量翻倍，有没有可能导致蛋白表达量翻七八倍？需不需要其他机制，如增加蛋
白稳定性，的存在？
十分感谢！ |
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l******g
发帖数: 1623 | 34 很少有人说重组细胞这个词
如果你是指stably transfected CHO cell line, 如果只是mRNA x2, 不太可能protein
x8. 用CMV 载体和常用的选择条件下，通常是protein folding/secretion 是bottle
neck. |
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f*****n
发帖数: 12752 | 35 万分感谢！
Folding 和 secretion 是瓶颈的意思是说这两个过程所需的endogenous chaperon 或
其他蛋白不够吧？ |
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k****z
发帖数: 1863 | 36 方舟子：实际上目前的检测方法不可靠
大嘴韩乔生 加关注
@叶诗文 用勤奋和汗水铸就的两枚伦敦奥林匹克游泳金牌的辉煌，是西方媒体中那些别
有用心的人抹杀不了的，欧美许多有名的运动员都对小叶挑起大拇指称赞。而国内有些
自以为专家、学者的人这时抛出这样的东西，我看他心眼长歪了。其言论更经不起推敲
。我们会用事实来回击的。
◆◆@方舟子： 1998年1月中国女游泳运动员原媛和教练周哲文去澳大利亚珀斯参加世
界游泳锦标赛，被澳大利亚海关查出携带了13瓶生长激素。这很倒霉，因为外源生长激
素与内源的一样，它的使用很难查。世界反兴奋剂机构认为通过血检能检测出运动员使
用生长激素，也有过被检测出的个别例子。实际上目前的检测方法不可靠。 转发(4805
) | 评论(3798) 8月2日 22:55 来自新浪微博 |
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b****r
发帖数: 17995 | 38 哇，熟了都这么厉害，我今天吃了个生苹果
听说苹果基因组里无数会在dna里插来插去的转座子
楼主你告诉我我以后长得会不会越来越像苹果啊 |
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w*****y
发帖数: 1201 | 39 不同物种之间的转座子不是完全可以互相跳来跳去的，一般只局限于相同物种或相近物
种，但是这也不是完全不可能的。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 41 幸好我喜欢吃的是红苹果
如果喜欢吃绿平果就麻烦了，可能会变成绿巨人 |
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p****n
发帖数: 9263 | 42 俺更不怕，俺喜欢的是那种黄苹果，还有哈密瓜，橘子汁...都不会变色哈哈 |
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B*******r
发帖数: 65 | 43 想象一下早上上班，某个橘汁色的同事跟你打招呼，你会不会问他是不是昨晚喝醉后，
在厕所过夜还没洗澡。 |
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l******8
发帖数: 1691 | 45 嗯，科学证明，中医的吃啥补啥理论是正确的，而且比现代生物学早了不知道多少年。 |
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b******k
发帖数: 2321 | 47 ls几位太mean了吧 人家好歹是有实验经历有data support的提问题的 你们几位凭的啥
？就凭你们没见过长的像苹果橘子的人？泊松亮斑的故事学过中学物理的都知道吧？ |
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b****r
发帖数: 17995 | 48 我见过长得象苹果的啊，这正是让我担心的地方，我可不想长得也像苹果 |
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z****u
发帖数: 1007 | 50 今天刚被养的一只Cre;GFP 老鼠咬了一口。。。血流成河。。
从今开始天天拿荧光电筒照自己看看给转染没。 |
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