t******t
发帖数: 36 | 1 小弟我研究工作涉及蛋白之间相互作用。实验室的工作流程大致是先找感兴趣蛋白的
binding partner through Mass Spec, 然后根据binding partner去characterize
this interested protein. 往往还要用pull down 等方法找到partner的binding site
on the target protein.
在工作过程中，我感到很多时候要很清楚的搞明白蛋白间的相互作用，structure
biology 方面的知识很必须。我是生化背景，structure biology方面基本是外行，
请各位师兄师姐给些关于学习structure biology的建议，有什么推荐的教科书吗？
（我目前不做structure方面的工作，我们实验室往往是合作者做结构的部分，我们做
生化分子的部分。但很多时候，我要用的structure biology 方面的知识，比如根据已
有的结构设计点突变去abolish the binding between two protein; 在已经知道结构
的蛋白上某个位点的磷酸化是否会改变其... 阅读全帖 |
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S**********e
发帖数: 1789 | 2 用promega的试剂测caspase3/7火星。明明细胞凋亡了，但结果比control还低，不知道
什么原因。
是不是活性太高了，把底物用光了？
请指教 |
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i**y
发帖数: 71 | 3 无意中发现了一个热门蛋白识别底物时的一个以前不知道的规则，跟它的功能有很密切
的关系。虽然是很确切的data，但是都是体外的实验，暂时不知道这个蛋白在体内行使
功能的时候受不受这个规则影响 =） |
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o**d
发帖数: 3080 | 4 你想问的是ubuitination的底物有没有保守的motif吧，肯定都有个K。但motif好像没
有听说过。 |
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o**d
发帖数: 3080 | 5 如果H蛋白本身是E3 ligase，自泛素化的可能性就很大。但也有可能只是个泛素化的底
物。如果MG132处理之后，H蛋白的量增加，说明很很可能是K48－ubi，如果没有增加，
也有可能是K63－ubi。 |
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L*****t
发帖数: 56 | 6 有一个醛缩酶在体内的反应如下
X ----> Y + Z
具体反应机制暂时不明，但应该是ping-pong mechanism
文献中测活的方式体系是再加一种酶把Z转换成可以显色的产物，但是我发现实际上Y甚
至X也参与第二步反应，也就是说这是个Dirty System，尝试过用数学方法分析但是数
据本身的可重复性也很差，可能是因为底物X的纯度不够，总之是一团糟。
还有一种测活方法就是利用逆反应：
Z + Y ----> X
X也可以转化成可显色的产物，试验的结果很不错，重复了几次都差不多。但是得出的
数据和另一个反应方向依然无法统一。问题是我要怎么说服老板相信只有这个方向上的
数据是可信的？一个可逆反应，两个方向上的Kcat是一样的吗？ |
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x**2
发帖数: 255 | 7 ping-pong mechanism不是要有两个底物的么？ |
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L*****t
发帖数: 56 | 8 两个方向上饱和底物都是Y，而且Y过量的话感觉有Substrate Inhibition
kcat的问题我想清楚了，谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 因为其实就是一个抗体库，用来检测蛋白表达应该可以，用来真正测序则有难度，
特别是因为蛋白会折叠，所以很多地方是检测不到的。如果用trpsin digestion
然后把切出来的小肽用来做底物的话，则复杂度大大增加。 |
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a******2
发帖数: 470 | 12 最近做qPCR，机器刚calibration。用以前用过的标本体系测试发现扩增曲线异常，而
且看不到Ct值。不知是什么原因。上网查了一下有人说可能是底物浓度过高，但稀释
100倍后还是同样结果。我用的是bio-rad iQ5机型，不知用不用重新设定基线或者阈值
？如果用的话怎样设定？希望有经验的战友帮忙解决一下。非常感谢。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 13 总体来说，licor odyssey还是不错的。荧光二抗不是问题。300块100ul可用几个月一
年。
好处是大大节约了步骤和时间。不需要底物反应和底片曝光。
最大的好处，上面都没有提到。licor可以同时识别两个波长的荧光。假设你需要计算
蛋白X的磷酸化比例。你可以在同一张膜上同时孵育两种抗体：总x，磷酸化x。当然，
这两种抗体必须来自两种动物（比如小鼠和兔）。然后同时孵育两种二抗。这两种二抗
要连接不同荧光，一个波长680（红），另一个800（绿）。
扫膜将同时显示红绿两种颜色。定量时划一个框，软件会显示框中红绿荧光两个值。两
者的比值真实反映磷酸化比例。任何其他单色wb定量算出的比值都是估算值。
不仅如此，licor扫描出来的彩色条带还可以从视觉上很直观地显示磷酸化比例。假设
磷酸化x标记为红，总x标记为绿，那么磷酸化高的条带偏红，磷酸化低就偏绿，磷酸化
水平适中就显示黄色（软件自动设定红绿叠加结果为黄）。发文章的时候，视觉上比显
示两遍黑疙瘩（一个是总x，另一个是磷酸化x）好。
另外，此设备对gfp的荧光敏感，凡是gfp需要定量的样品，包括细胞培养皿，甚至小鼠
（或其器官）都可... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 你说的这些alpha家的还有bio-rad家的也可以的
alpha家有5个滤镜的位置
bio-rad是3个位置（虽然可以用的滤镜有5个还是6个的）
就是不能同时照
分两次照可以的，只要不动胶的位置，bin的设定一样，就可以merge到一起
bio-rad上可以分别放上pseudo color
出来效果一样的
也可以画框定量
ECL的话底物反应时间不过才5分钟
跟整个做western blog的流程相比
省个5分钟没有省很多啊 |
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T**********t
发帖数: 25 | 15 本穷无聊之际，搜索了一些国内高校的新提拔上来的青年科研骨干，发现很多有意思的
地方，对学术腐败有了一些总结,希望这个对回国的筒子也有一些帮助，毕竟回去要和
这些流氓去竞争岗位。
１.数据造假
这个最常见，国内国外都存在，比如用前段时间众撸友挖出的Photoshop做western
blot图等，这个就不多说了。
２.数据重组
就是把以前发表过的文章重新组合，再投到不同的杂志。之前帮老板审稿时就遇到，老
板火眼金睛，一眼就看出来直接ｒｅｊｅｃｔ。
这个比较难发现，除非在这个领域比较熟悉，每天都阅读大量相关文章。
3.相互署名法
就是A和B是熟人／哥们／夫妻等等，相互署名发文章，但之间没有contribution。本穷
搜索到当年在国内呆过的某高校，一对新来男女青年科研骨干，在香港三年读博士期间
（非博后）就发文２０多篇，让本穷汗颜不已。因为这三年就是不做TA、不上课，完全
拿来写ｐａｐｅｒ也很难写２０多篇，更何况还有修改文章的时间。这至少１－２个月
就有一篇发表，非常令人怀疑。后来仔细一看这两个人完全一样的文章，只是名字前后
顺序有异而已。而此二人又同时找到同一个高校工作，这个里面应该有... 阅读全帖 |
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c******r
发帖数: 3778 | 16 HSP如果被完全抑制会怎么样？sorry我对这个HSP不是太熟悉。是不是在没有stress的
情况下问题不大啊？细胞会死么？
当然，肿瘤，手术等等都是stress，这时候抑制HSP会有什么结果还得实验了才知道。
我的理解是，90量大，所以如果抑制了，绝大多数作用就被抑制了。其实可以有两个不
同的解决方案。一个是如果70/90结构足够接近，可以直接两个一起抑制。design一个
dual suppression的药物应该也不是太难。不行两个药物一起用也没啥不可以。另外一
个办法就是看看他们俩的pathway是否重合，可以抑制底物也行。 |
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j*****q
发帖数: 82 | 17 sybr green的方法。primer express设计的引物， 没hairpin，没dimer，在载体上扩
增很漂亮，线性化也很好。但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
很接近，而且都偏大，28，29的水平。
这样的现象能是什么问题呢？引物本身的问题吗？
多谢了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 18 首先，你设计的时候考虑到了基因组上的intron 了么？
第二，一般来说，基因组做底物很麻烦的，一个是量的问题，第二就是特异性的问题。
所以很少有人这么做。
但是如果非要这么做不可的话，必须放很大量进去（你自己算算摩尔数，要放到和你放
的plasmid 差不多的量得放多少，不要盲目用ug 这些重量单位，那个不算数的） |
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j*****q
发帖数: 82 | 19
might
确实是。一样的底物，换了一组primer就work了。但是其他几个target，试到现在的
primer pair都不work。按理按照那些规则来设计的primer，应该没问题啊。难道只有
不停的试？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 “但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
很接近，而且都偏大”
——除了上面这么多id说的，
另外还有一个情况要注意，gDNA提取过程中很多时候会带有PCR inhibitor
有的是样品带来的（比如environmental sample可能含humic acids， polyphenols
），有的是提纯过程中引入的（比如EtOH去的不干净之类的）
所以不是模板越多就越该P出来的
很多时候稀释模板以后反而能够P出来就是这个道理
因为稀释的时候PCR inhibitor也被稀释了
你这个“不同第五浓度Ct值很接近，而且都偏大”可能就是这个因素 |
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g*****n
发帖数: 250 | 21 在5%NGS,0.1%Tx100溶液里加点抗体。NGS还得要。HRP coupled
anti-mouse Ab 可以用，只要你不用其底物来检测。1:500－1000 1hr。 |
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K**4
发帖数: 1015 | 22 终于仔细读了你提到的那片文章
涉及到的Sirt members充其量有个底物特异性和活性大小的问题
上升不到什么推翻前有的定论，又什么paper retraction 的高度
和LZ要表达的问题性质完全不是一码事
against |
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s******n
发帖数: 110 | 23 激酶检测（kinase assay）是在试管中进行的（in vitro），每次只有一个底物，要么
是A，要么是B，而且都是纯化的蛋白。因此它们之间的影响被消除了。 |
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m*********r
发帖数: 49 | 24 蛋白量过大--->荧光底物消耗过快，这种情况好像会导致你描述的那个halo样的条带。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 25 过表达蛋白发生高度的泛素化是很正常的。
很多E3 ligase自身泛素化，他们的底物也会有这一现象。
我做的蛋白起码有3个有类似现象。 |
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g******o
发帖数: 96 | 26 target protein可以被上游kinase磷酸化。serine突变成aspartic acid有表型，可是
serine突变成alanine没有表型。reviewer认为这个位点在正常生理情况下不怎么重要
，并要求解释原因。我的解释是这个位点在in vivo 被高度调控，可能有phosphate不
停的去磷酸化；也可能只有在特定的条件下才被磷酸化。
有人知道有这样的例子吗？只有D mutation 有表型而A mutation 没有表型的。
谢谢！ |
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l****y
发帖数: 398 | 27 这种情况不少， 蛋白一般不是被完全被磷酸化的，大概10-20%吧， SD mutant放大了
磷酸化的效应，所以reviewer是有道理的； 你的解释也很有道理，再来点redundancy,
secondary sites...
reviewer买不买就只有听天由命了。 |
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g******o
发帖数: 96 | 28 多谢回复！in vivo磷酸化比例确实很小，也有别的位点影响。不过只有这个site S-D
表型最强。能给个具体例子吗？ |
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g******o
发帖数: 96 | 29 这个protein S-D 蛋白变的stable，降解慢。按道理来讲S-A应该降解的快才对，可是
和wt没什么区别。 互补实验也是这样D mutation有表型，A mutation和wt一样。 |
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s********r
发帖数: 312 | 30 是蛋白质本身biochemistry的表型，还是建立的细胞系这种情况下的表型？n n[发自未
名空间iPhone版] |
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g******o
发帖数: 96 | 31 biochemistry和细胞系（KO cell line rescue）都是一样的，只有D有表型。 |
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s********r
发帖数: 312 | 32 可能跟p53一样，phosphorylation对activity影响不大，只影响stability n[发自未名
空间iPhone版] |
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p*****c
发帖数: 116 | 33 跟你用的细胞株有关，有些肿瘤细胞内kinase活性超强，WT transfection其实自动被
磷酸化变成D mut状态。 |
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m*********r
发帖数: 49 | 35 我刚想求证下甲基化底物SAM的事，就直接被你回答了。
再次多谢楼上各位的持续帮助！ |
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e**r
发帖数: 1144 | 36 真核细胞里 Ser/Thr Kinase一般都是有很多底物的吧？
有没有只特异磷酸化某一两个蛋白的kinase？
还有，Kinase的特异性主要是Kinase domain决定的还是recruit决定的？ |
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K******S
发帖数: 10109 | 37 CoIP's background is noisy. try tandem affinity purification (TAP), followed
by MS. |
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s*******n
发帖数: 37 | 38 你不能用phospho P38去检测p38 inhibitor,inhibitor 结合kinase domain,和
activation domain 的磷酸化是两回事。你应该用p38底物(mapkapk1?)的磷酸化去确
定抑制剂的效果。
activate
in |
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z*t
发帖数: 863 | 39 a-KG是tca cycle一个重要的node，很多酶也用它来做底物，肯定是很有意思。
最近又细读了他们的paper发现他们tca cycle代谢物量用的相当高，8mM,快赶上血糖了
。。。
tca cycle代谢物血清浓度只有uM级。 |
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t**m
发帖数: 158 | 40 很nb的里程碑式工作! 不出所料的话后面应该有高分辨率晶体结构的跟进
gamma-secretase的底物识别以及膜内剪切机理要是弄明白了拿大奖还是很有希望的
而且目前所有几类膜内蛋白酶的结构都是Shi解的, 是凋亡以外Shi最主要的领域 |
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y***i
发帖数: 11639 | 41 家族病的不是这个complex有b变异就是app 也就是它的底物有变异。重要性是毋庸置
疑的。其实这个脢更重要的功能是Notch的剪切脢。 |
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d*******g
发帖数: 8992 | 42 终于有个业内的人给他们科普一下吧。
结构学确实主要对于了解molecular mechanism.
说解一个晶体就了解了95%的动态信息，那是无知。
说晶体或结构一所是处，也是类似的。
结构学对于蛋白质的调节机制（小分子变大分子，开关状态，构型的变化）是很重要的
，还有就是加上点突变等等来测定重要的residues,看它们如果影响分子内或分子间的
相互作用。
真的要做到制药相关，差不多就是蛋白质的点突变结晶，加上小分子的突变，来获得合
适的酶与底物复合体。
模拟在现阶段，没有晶体、NMR和电镜的结构为基础，就是个屁。
rate |
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j******i
发帖数: 939 | 43 看来真是个演说的好手！能把生物说的这么激动人心！恕我愚昧，有几个地方不懂。（
1）如果要跟踪protein-protein interation，难道不是用基因编辑的方法在内源蛋白
上加个标记更可行？（2）即使用某种方法把抗体转到细胞质，不是还需要加二抗和底
物吗？（3）我确实有方法将小蛋白转进细胞质，抗体可能太大了（150kd?)，看来成不
了首富了。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 45 这个估计只能在无氧条件下提，
还原态的Fe才是有活性的，O2是底物之一吧？你的铁已经是三价了，失去了被氧化的能
力，也就没有活性了。
如果没有无氧的条件，试试看提纯过程中加入适量DTT之类，同时把Buffer都Degas一下
。测活的时候再输入额外的O2。
， |
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C*********h
发帖数: 83 | 46 pY phosphorylation of Tyrosine
AGC AKT都是底物。 |
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x*********n
发帖数: 43 | 47 同一个家族的蛋白A和B，都是一种水解酶，能水解不同的底物分别是a和b，其中蛋白A
不能水解b，但是能抑制B水解b的活性。现在想通过一些体外体内实验来搞明白抑制的
机制，想问问有没有这样的例子，可以让我借鉴一下怎么设计接下去的实验。谢谢 |
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r******k
发帖数: 446 | 48 小弟最近检测一个蛋白的磷酸化水平，看这个蛋白是不是一个phosphatase A的底物。
结果上15ug的时候，有A的细胞系和没有A的细胞系这个蛋白在变化很大。 我又上了
30ug，结果变化就不大了。这是怎么回事？ |
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d**b
发帖数: 1286 | 49 房子不要很大，但是要一个很大的地下室，干什么用，待会儿再说。
大理石地砖，波斯羊毛地毯，法国的桌子，意大利的椅子，此类物品一概杜绝，墙面，
地面，桌面，全采用PFA材料，耐酸耐碱耐高温易清扫，不用担心污渍，脏了，盐酸，
烧碱，双氧水，换着泼，刷完了，用自来水洗15遍，蒸馏水洗5遍，超纯水洗3遍。（当
然是花钱雇人刷，小姐我养细胞刷的瓶子表面积加起来都铺N间房的地板了，看见国产
玻璃细胞培养瓶就感觉吃了一口臭鸭蛋。）
德国schott的试剂瓶，大中小买全套，500mL的拿来喝茶，2L的插花，100mL以下的是佐
料瓶，密封好，定量超准，还耐热冲击（这点是我最欣赏的，非常精准的工艺。国产玻
璃器皿，热冲击很容易就爆裂，拿去灭菌，十个有八个拿出来是碎的。）
玻璃的觉得重，还可以用硅化塑料的，防水不吸附，不用刷子也能洗干净。
METTLER TOLEDO的电子天平，称佐料的。
Eppendorf的移液枪，Axygen的吸头，当然是炒菜时用来加酱油和料酒的，用汤勺多不
准阿，还容易撒出来。
洗碗，安利洗洁精多土啊，sigma进口分装的NP40，triton X-100，triton X-114和... 阅读全帖 |
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r******k
发帖数: 446 | 50 嗯 发在science上的 fak是pten的蛋白酶底物 很多实验室都重复不出来 包括我们实验
室。。。。 |
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