d****i
发帖数: 2346 | 1 我们从老鼠分离出来细胞，裂解细胞后酚氯仿抽提DNA，沉淀后溶于20uL水。随后用
QIAGEN的kit进行convert和纯化，用Tis洗脱后做模板进行PCR扩增，产物用来做
pyrsequencing检测甲基化程度。
问题：PCR的时候条带很淡，有的sample扩增不出来。可能的原因是什么？
第一批sample模板用量6uL的时候扩增不出来，减少到2uL可以，条带很明显。
第二批sample用同样的办法，摸索了不同的模板量都不能成功。
谢谢！ |
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d****i
发帖数: 2346 | 3 大家都用哪个kit抽提DNA？
那个kit进行convert？我们现在用的是QIAGEN的，但是那个bisulfite mix每次都不能
彻底的溶解，tube下面总有一点颗粒的东西不能完全溶解，放60半小时也不行。 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 4 是这样啊。可是我刚刚抽提好的质粒，是没有这一条带的，放上几天才出现。是否放置
本身也会让质粒变性呢？
20 |
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A***g
发帖数: 191 | 5 我的蛋白就是抽提的不同human cell line的核蛋白，不是什么特定的蛋白。不过可能
buffer会有问题。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 9 那个老鼠已经被折腾得够呛了……不想再刺激它了…… |
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j****x
发帖数: 1704 | 11 这个难说，mini的KIT质量是良莠不齐，我曾经用过一个之后连GFP转染都有问题的。
按LZ的说法，抽提的质粒浓度低质量差的话，本身就说明不正常。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 12 这个问题在本版应该就讨论过不下三遍了，好消息是你绝不是第一个遇到类似问题的人
，坏消息是可能没有特别的解决办法。
我记得之前有一例是，换过菌株，换过培养条件（培养基温度时间什么的），换过抽提
方法，但是maxi就是不正常，最后只好大量小提然后再合并。
你可以试着换一换各种条件，或者试试看midi，也许有用也许没用，试过才知道。好运！
plasmid
, |
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b**********8
发帖数: 349 | 13 体外甲基化修饰后的质粒是直接用来转染细胞的，不用做转化和质粒抽提，应该不用考
虑抗性丢失的问题了吧？ Anyway， thanks a lot！ |
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h****k
发帖数: 182 | 14 使用的是tissue, 书上写的是不要超过30mg, 30mg看起来是个3mm的小方块。过量使用
tissue后效果会怎样？另外加了RLT buffer之后RNase还会降解RNA吗？ 书上写的是RLT
buffer含有guanidine thiocyanate. |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 关于用量，没有那么严格的。多一点少一点组织无所谓，关键是你得确认所有组织都被
溶掉了，否则就一方面堵树脂，另外一方面带入过多污染物。
你可以多加点裂解液，多处理一回，然后视需要全部倒进一个小管或者分成几个
管。
RNase一般比较皮实，所以没人能保证RLT buffer一定能灭活，该注意的地方还是要注
意的。
RLT |
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n********k
发帖数: 2818 | 16 more buffer and complete and fast lysis will do it...For a beginner, do
yourself a favor and NEVER try to save on buffer---the key is complete
lysis with enough buffer...then it can last fairly long, as long as it is fully lysed, no worry about RNase until the column step...if in doubt, use
RNAlater...it is fantastic...
RLT |
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c********b
发帖数: 363 | 17 it will reduce the quality and yield of RNA. For beginner, never try to be
greedy. More is not always good. |
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h****k
发帖数: 182 | 18 really good suggestions. thanks! |
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a*******a
发帖数: 4233 | 19 少量细胞是多少？
以前用10个小鼠oocyte抽rna，用专门的微量rna 吸附柱kit
我在国内用天根，那么qiagen应该也有类似的
抽提过程加DNAse消化的,洗下来全部反转录到20ul体系
取1ul做realtime， gapdh ct大概17-18 |
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a*****v
发帖数: 128 | 20 最近小弟做突变，同时做几个克隆，其他的都正常，可以插入可以测序，只有一个质粒
，他可以在真核细胞表达但是需要在Ecoli里面扩增，我做了突变，但是无论如何都没
法测序，回来的峰一片混乱。
但是，template可以测序，我用同样方法抽提的其他plasmid也可以测序，只是这个突
变以后的不能测...
然后听技术员说，有的公司可以保护vector不让别人做突变或者修改，有这样的技术么
？ |
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t*d
发帖数: 1290 | 21 看了几篇文献，没搞懂他们的technical replicates 是怎么定义的。
引用比较多的那篇“Marioni JC, Mason CE, Mane SM, Stephens M, Gilad Y: RNA-
seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene
expression arrays. Genome Res 2008, 18:1509-1517.”他们的technical
replicates 是把构建好的短片段放在不同lanes，然后比较不同lane 出来的读数。
因为RNA-seq 很大一部分工作在如何构建最后测序的短片段库，而且这个建库的过程相
当繁琐，可能会带来很多的variation。我觉得更严格的technical replicates 应该从
RNA 抽提开始。比如，一份细胞分两管，分别进行建库和测序，然后再比较读数，看看
varation 有多大。
那位同学能不能推荐几篇比较这种更严格的 technical replicates 的文章？多谢了先！ |
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b**********8
发帖数: 349 | 22
2/
这位战友用不着惊讶，因为我们实验室很少handle genomic DNA，所以你说的那些kit
我们确实没有，这次我只有两个sample，就想用传统的蛋白酶K消化酚氯仿抽提得了，
以前做过组织的，现在是培养的贴壁细胞，处理上应该有点差别，而且样品比较宝贵，
所以想搞个可靠地protocol，kit就不考虑了。老板虽然钱不多，但是该买的东西从来
不眨眼的，不过为了两管DNA还要去买个kit，我自己都不好意思开口啊。
另外，有谁知道TNE buffer的配方不？我们组之前的posdoc一直用这个buffer+蛋白酶K
消化细胞，然后直接加饱和氯化钠，离心取上清后用乙醇沉淀。不过最近这个buffer找
不到了，她也没留下配方，网上找了几个貌似差别还蛮大，谁用过的，确实可靠的，甩
一个给我吧，谢了。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 23 这位战友，你早说你就2个样本啊，而且还比较宝贵，那就更应该考虑kit了。不过允许
我嘲笑一下读书读傻了都，呵呵。
最简单的办法，打个电话给公司，直接要一个demo，大部分公司（尤其中小公司）都会
屁颠颠的立即给你寄一个4-10个样左右的demo kit，足够你用的了。而且这种基本试剂
盒原理简单，不存在不同公司效率差别很大的可能，放心使用，比你用传统酚仿抽提肯
定靠谱。
对BTW，于提取基因组DNA，基本上组织样本和培养的贴壁细胞没有本质差别，以前的
protocol都是一致的，现在的kit也都是两者通用。
kit
酶K |
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j*******e
发帖数: 23 | 24 Postdocs
Multiple postdoctoral positions are available in Dr. Jiankui He’s
laboratory in South University of Science and Technology of China (SUSTC).
Dr. He is building up the Genome Center at SUSTC, with the most advanced
high throughput sequencers such as Illumina Hiseq, Miseq, Ion Torrent and
Roche 454. We are initiating an international collaborative study “The
International Human Immunome Project”. The International Human Immunome
Project aims to sequence the immune repertoire of 10,000 pat... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 25 最近开始做这个实验，大概流程如下，RSB+0.5% NP-40 分离nuclei，然后用NEB 公司
的 DNase I （浓度分别为0,8,16,32,64,128 Units/ml）在37度切25min，加EDTA(
final conc 5mM)混合后75度10min终止反应，蛋白酶k 56度过夜消化，酚氯仿抽提。取
2ug 基因组DNA跑0.8% TBE 胶，理论上随着DNase I 酶量加大，应该能看到一个DNA逐
渐变碎的过程，可是我做了几次，都只看到一个很微弱的趋势，我现在有两个问题想请
教大家，
1）是否一定要在DNase I 处理后看到一个明显的基因组DNA变碎的趋势？
2）NEB网站上建议的DNase I处理完毕后需要加一定量的的EDTA，再75度10min，但是我
看别的文献里说EDTA是用来保护mRNA不受降解的，适用于做reverse transcription之
前去处RNA样品中残留的基因组DNA。我这个实验里需呀尽量除去RNA，是否可以不加
EDTA而直接做heat inactivation？
请大家帮助，谢谢 |
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w******n
发帖数: 767 | 26 哈，我遇到过，提小鼠肝脏RNA,最后有一大坨白色的，溶不了。解决方法请按照TRIZOL
说明书严格操作。
1.裂解要充分，悬液要透明，看不到没溶的组织。
2.氯仿抽提离心时间要足够。
3.4度离心。
最后得到RNA应该是速溶的。 |
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I***a
发帖数: 13467 | 27 2.氯仿抽提离心时间要足够。
－－－－－一般多长时间啊？ |
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b******s
发帖数: 1089 | 28 虽说理论上这两个酶在大部分buffer里活性都不错。但实际上并不一定所有的组合都好
用。
尤其是有时候在非最佳的buffer里会有star acticity。如果同时做双酶切出现问题，
可以考虑做sequential digestion。你不必每步都抽提，可以先用离子浓度低的buffer
第一个酶先切，然后换成离子浓度高的buffer，用第二个酶切。如果切的时间足够长，
酶量足的话，我觉得不一定要加CIP，这样会促进其后的连接效率。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 29 透析和直接稀释区别何在？文献上都是透析。
比如抽提细胞系的细胞质和核蛋白纯化complex，我一直是这么做的：
harvest 细胞。加5倍细胞pellet体积的低盐溶液（20mM KCl），冰上放10分钟，用
homogenizer捣12次（用tight的B型活塞），3500 rpm离心10min，上清取出，加0.11倍
体积的1.4M KCl，使得终浓度成100mM，我看文献上说要10万g离心若干小时。可是我们这没有这
样的离心机。只能最大速度（5万G）离心1h，作为细胞质抽提物
S100，分装后液氮速冻，-80保存。这一步很难，因为不管离心多久，都有脂状物质悬浮着，得到的
是浑浊的东西。
对于pellet，加两倍体积的420mM KCl。用homogenizer捣若干下，把鼻涕状黏糊糊的东
西充分散开。然后4度摇30min-1h。然后1万2千g离心30min，分装后液氮速冻，再放-80
，作为nuclear extract。
不知道液氮速冻这一步对于防止蛋白变性有好处，还是别的原因？为何需要速冻？
如果用于蛋白复合物的纯化，我以前是用300mM的盐。但是boss让我改成250mM... 阅读全帖 |
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f*****f
发帖数: 195 | 30 单独EGFP，用-20 C Methanol 固定时，发现很多细胞荧光变得极暗或消失（4%PFA正
常），是因为Methanol 消除了GFP的发光信号还是抽提了GFP蛋白？也就是说用GFP抗体
是否还能标记出来？ |
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W*********n
发帖数: 775 | 31 本来我也没有用蓝白斑，但是挑了10都是PCR都是阴性；然后挑了4个培养抽提质粒然后
酶切，仍然没有看到我的目的片断，就用蓝白斑法一看，全是篮板。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 32 这个不是污染的质粒，很可能就是你的目的质粒
但是因为溶液2处理时间过长（就是lysis solution）
导致你的部分目的质粒变性了，这种变性的质粒resistant to enzyme digestion
你可以回头查查qiagen的质粒抽提的说明书 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 你简直是在提取genomic DNA 吧 啊?
50 kbp length 以上的Gel picture 白的亮眼球的 都是 Genomic DNA
氯仿or 意丙醇抽提的话 接近界面的 界面附近液层的 移液枪的chip 尖端 不得在碰到那个位置的时侯
有丝毫的吸液的大拇指的松动的动作
酒精沉淀 以及清洗的分离液体作业的时候 同样
好的RNA Extraction PP 如下:
[回复]
[ 5 ]
发信人: contain (containor), 信区: Biology
标 题: Re: 还是RT_PCR
发信站: BBS 未名空间站 (Thu May 24 22:06:11 2012, 美东)
RT之前为什么一定要用dnase处理？我现在的问题不是有DNA污染，而是RT-PCR之后什么
产物都没看到。 |
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v****e
发帖数: 131 | 34 最近用老鼠组织提RNA，准备做microarray，可是RNA降解了。损失了`20个老鼠，非常
不幸。
dissect tissue，每个老鼠take 10分钟，因为比较难剥。是不是这个原因？放在RNA
LATER里比较难剥，因为变硬了。
然后就直接把tiisue放在液氮里了。抽的时候，放在trizol里。用匀浆器打散，抽提。
最后用RNAEASY纯化，
大家觉得有什么问题？有人和我说用液氮磨碎组织再加trizol，有用吗？谢谢 |
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g******a
发帖数: 63 | 35 RNA不至于这么快降解吧，觉得你操作没问题啊，我们有时候取组织种类比较多，还要
分别称重，十分钟一个老鼠还算快的，是不是后面抽提的问题或者trizol出问题了？X |
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k******0
发帖数: 1073 | 36 试试vivapure spin column离子交换柱。
基本上象质粒抽提，上样离心，蛋白质结合，其它（包括ATP）通过，加高盐洗脱蛋白
质。5min搞定。
很好用的柱子。我用于浓缩蛋白质长晶体。 |
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g***s
发帖数: 30 | 37 我在用果蝇做代谢，想抽提成虫的hemolymph去测量glucose,尝试了一下砍头然后离心
的方法，几十只果蝇也离心不出1ul的hemolymph，有没有哪位内行知道比较可行的方法
？ |
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h******y
发帖数: 351 | 38 1. 你抽提的DNA有问题。
2. 试试其他酶，例如EcoRI
by the way, 你用的酶量太大。
did
not |
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l**********1
发帖数: 5204 | 39 Thx, Cosimo2014
5 Ys ago her web 1.0 verson about 给Bio 本科生进Bio实验室的一些建议
发信人: nyouyou (BIR), 信区: LifeScience
标 题: 给本科生进实验室的一些建议
发信站: 水木社区 (Mon Nov 5 02:12:18 2007), 站内
我曾经是DBSB的本科生，大二暑假进了一个实验室，课题听着有意思，但条件不成熟，
做不下去，只记住了氯仿抽提，也没真正动手。
below ignored
pls go to
HTTP : //bbs.sysu.edu.cn/bbstcon?board=LS&file=M.1194368384.A
考古买买提 Bio分舵 下 即可:
http://www.mitbbs.com/article_t/ECUST/31173733.html |
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w******a
发帖数: 65 | 40 是全细胞裂解液（whole cell lysates）还是Triton extracts 或者RIPA extracts？
我的个人经验，如果是Triton sample （通常用于co-IP），有一种可能性是抽提不完
全，药物刺激F-actin增加导致这一部分的骨架蛋白不溶于Triton lysis buffer。但如
果是WCL或者RIPA sample就要考虑其他的原因。 |
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h******y
发帖数: 351 | 41 先用Trizol抽提RNA，加氯仿分层后，取水相，向其中加等量乙醇，然后过RNAeasy的柱
子。方便简单，无DNA污染。
啊？ |
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m******e
发帖数: 459 | 42 关于基因组DNA抽提纯化，用Qiagen的kit当然得率更高，纯度更高，但成本也高。我对
哺乳动物或者植物基因组提取没有经验，但是从酵母细胞中提取基因组我一般都是手提
，用异丙醇沉淀粗提基因组的上清，用TE溶解沉淀后加RNAse（确保没有DNAse污染）处
理，然后用酚氯仿抽替两次除去RNAse和残留的nuclease，最后加乙醇沉淀后测吸光值
定量。
关于探针克隆后测序，我觉得主要是确保序列是你想要的探针片段，因为不能排除直接
从基因组扩增出来的非特异片段正好跟你的探针大小一样。
关于探针突变的问题，如果你用末端标记法标记探针，PCR引入的点突变可能会有影响
，但是如果你是用切口平移法或者最常用的随机引物标记法，那么影响基本可以忽略。
我只用过随机引物标记地高辛和磷32,用普通taq酶做PCR完全没问题。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 43 现在有些proteomics的工作，抽提蛋白做SDS-PAGE（不是双向电泳）
然后割胶做LC-MS方面的工作
如果有糖蛋白，怎么能识别出来？因为糖基化修饰有时候很未知的，你不知道有几个糖基
我理解MS就是得到一个肽段的分子量，然后跟已知肽段分子量比较
如果目的肽段有可能糖基化，是不是很有可能无法鉴别出来？ |
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y****n
发帖数: 8 | 44 1)抽提的是细菌基因组DNA，核糖体DNA是基因组DNA的一部分
2）16S rRNA基因DNA序列是指16s rDNA序列,rRNA是rDNA基因表达产物
3）从基因组DNA中扩增的当然是16s rDNA。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 45 试试Ambion的kit？
还有上RNAlater
for
80204 |
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s******s
发帖数: 13035 | 47 价格不知道。你可以看看facility里面有没有 |
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z**********8
发帖数: 766 | 48 谢谢各位回复！
问过我们的facility，没有MagNA，老板不可能现在去买 ：（
细胞离心后的沉淀已经冻存在-80，当时没有加lysis buffer或RNAlater，现在只能抽
提RNA前立即放在干冰上加RLT buffer。
有人有qiagen kit的经验吗？是不是用RNAeasy只抽RNA会比抽DNA和RNA更好？ |
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l******u
发帖数: 936 | 49 骨髓细胞的RNA质量本来就不高，我们实验室从老鼠骨髓抽的都不高，何况病人样本。
Qiagen只抽RNA的kit质量更好，买个RNeasy Micro Kit |
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