z**********8
发帖数: 766 | 1 加了，照着protocol做的，你觉得这是导致降解的原因？ |
|
z*********8
发帖数: 1203 | 2 bme可以抑制RNase的activity，不过既然加了，我觉得是样品开始的时候就没有存储好
的感觉，你在liquid nitrogen里面snap freeze了么？或者你加RNAlater或者trizol了
么？其实，我个人感觉cell里面提RNA还算不是最难的，有些tissue是真心难！ |
|
|
k******0
发帖数: 1073 | 4 以前北大陈大忽悠，恐龙蛋中抽提基因物质，推测出恐龙和鸡的亲缘关系，成了大笑料。
希望历史不要重演。 |
|
e*r
发帖数: 103 | 5 为什么酸性酚能使RNA 进入水相但却使DNA保留在有机相？ |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 6 这个可能得问有机专业的。我瞎说：
感觉是酸性条件下，酚苯环上的OH基团保持原状，在碱性条件下是O-。也就是说酸性条
件下，酚作溶剂的极性没有碱性条件下强。在有机分子里，氧是极性的标志，DNA和RNA
的差别是一个O的多少，也就是RNA极性大。另外，相对DNA的碱基C, RNA的U上面少一个
甲基，也有利RNA溶于极性溶剂。 |
|
|
|
s******s
发帖数: 13035 | 9 你搞啥捏。没出核的就是pre-mRNA啊。
细胞里面基本是先polyA再剪切的，polyT调出来的RNA
很多有intron, 当然取决于抽提方法，尽量保留核结构
大多数就出不来了
）。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 10 要省钱省时间都不用碱法。我以前做过热解发，直接从plate用牙签
把colony刮下来，放到裂解液里煮个几分钟就可以上样了，省了所有
抽提步骤，而且省了一天的试管培养时间。坏处是，没有片段太小
比较难区分，因为没有酶切 |
|
z*******9
发帖数: 112 | 11 有两个问题，想请教作Random Mutagenesis 的同仁，
1. 建完mutant library后，一般需要把bacteria涂板后，然后再把平板上所有的菌落
刮下，抽提DNA,
（这一步，我能不能偷懒，直接就把transformed的bacteria接种到液体培养基里，然
后直接抽最终的bacteria DNA。)
这个问题其实就是，为何建突变文库的最后为何一定要涂板培养？
2. 还有就是，这里的细胞scraper的头太硬了，每次刮菌落时都要把培养基刮下几块，
想问大家有没有推荐一个头较软的scraper，或者对刮菌落有什么建议，谢谢， |
|
z*******9
发帖数: 112 | 12 谢谢，
不知在刮菌落时，您有么有什么tricks，我刮的实在是慢，我是先加一点Buffer1，然
后再刮，有人也告诉我，先把菌落刮到集中，所谓的先干刮，然后再用buffer1冲下来
，我总是担心干刮会漏掉一些菌落，
（Buffer1就是Maxi抽提的Buffer1）
Completeness |
|
l***y
发帖数: 638 | 13 平板上加点buffer或者medium泡一下，用个软软的小刷子刷，然后吸出来去离心就是
pellet
谢谢，
不知在刮菌落时，您有么有什么tricks，我刮的实在是慢，我是先加一点Buffer1，然
后再刮，有人也告诉我，先把菌落刮到集中，所谓的先干刮，然后再用buffer1冲下来
，我总是担心干刮会漏掉一些菌落，
（Buffer1就是Maxi抽提的Buffer1）
Completeness |
|
j****n
发帖数: 3370 | 14 我们实验室就是做酵母的
这个问题经常发现
刚开始怀疑是目标蛋白对 e coli有毒性 很多yeast promoter在e coli都有不同程度的
活性
后来发现即使有stop codon mutation的 也存在相同问题
共同的结果就是过夜抽提得到plasmid 浓度非常低 经常低于50 ng/ul
至于原因不清楚
目前
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
|
|
d****i
发帖数: 2346 | 16 老板急于做老鼠实验，我已经把genomic DNA抽提好了，跟技术员说“你有时间的话可
以做下genotyping...”。两周过去了，技术员还没动手，我给老板说让老板自己跟技
术员说做genotyping。结果刚看到老板给技术员email，cc了我，说xxx wanted me to
ask you if you could do genotyping...
技术员是美国大妈，实验室人少，不想有任何不和谐，结果被老板这样卖了。 |
|
a*****n
发帖数: 2835 | 17 蛋白沉淀最后应该在管底，用loading buffer溶解煮了上样
endosome
endosome
SDS- |
|
e****s
发帖数: 1125 | 18 一般的Protocol
Final Methanol 90% precipitate protein,
Spin >10000rpm fro 10 min,
Wash one time with 90% methanol,
Spin agan,
carefully decay super,
Air dry 15-30 mins,
re-suspend by SDS-buffer
我有时候把Wash那步给省略了。 |
|
|
|
a*****n
发帖数: 2835 | 21 你按照楼上的protocol或者自己google一个protocol做一遍试试吧，看样子你要么是没
有protocol要么就是还没有做过一遍，
氯仿最后跟甲醇一起去掉了啊 |
|
e****s
发帖数: 1125 | 22 我那个是一般甲醇沉蛋白的方法。
没用过氯仿。对蛋白来说，光甲醇就够了。氯仿可能是为了能有效的把蛋白从Endosome
的膜里抽出来。浓度你就自己搜吧。俺不知道。
通常甲醇用得多，是因为疏水性偏弱，只会沉蛋白，而不会衬核酸，所以处理细胞样品
很好。乙醇氯仿之类的就全下来了。 |
|
x*****e
发帖数: 309 | 23 其实更应该担心是ＤＮＡａｓｅ能否起作用，如何检测ＤＮａｓｅ起作用。有时候问半
天还不如自己做一下，生命短暂，用ｋｉｔ吧，尤其是你的样品是用来做ＲＮＡ-seq。
净。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 24 你trizol, chloroform污染过的水相，DNase不太可能有活性。
反正我都是用kit的。。。
净。 |
|
b*****n
发帖数: 1841 | 25 今天试了一下，这样处理genome DNA全部去除干净，除了RNA量有点损失外，其它一切
都好。 |
|
i*********0
发帖数: 915 | 26 如果不是微量的组织的话，可以考虑用，Tri-reagent.
RNA 抽提完了以后，跑个 胶看看有没有明显的降解，如果没有的话，可以直接交给
facility了。 |
|
O**********a
发帖数: 317 | 27 http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIyNDA2NTI4Mg==&mid=208906889&
王晓东谈诺奖：我们来了，我们还会经常再来
2015-10-14 王晓东 知识分子
文｜王晓东（北京生命科学研究所所长）
作者简介：
王晓东，1949年以后出生于中国大陆的华人科学家中，首位当选美国科学院院士者。
1996年，他发现线粒体释放细胞色素C介导细胞凋亡现象，由此发现了细胞凋亡的分子
机理，揭示出线粒体在提供能量之外的第二个功能。除此，他还是第一位在世界权威教
科书《分子细胞生物学》中独立撰写一章的华人科学家。2004年起，王晓东参与创办北
京生命科学研究所，2010年全时回国。他领导的研究所目前已成为世界一流研究所。
人活着，最困惑的无外乎“我从哪里来”、“要到哪里去”两大问题。有宗教情结的朋
友这时会指出，答案在他们那里、而不在科学中。因为科学有局限。
而我则会说：“其实，我们科学界也有实实在在的答案。我们不光能对这两个问题给出
解释，还知道你来这儿干什么。”答案就在我们现代生物学的两项伟大发现里：一个是
DNA双螺旋结构；另一个是遗传密码的解析。... 阅读全帖 |
|
t******5
发帖数: 67 | 28 gDNA 分子量非常大，如果抽提过程中动作轻柔的话gDNA不会裂成小片段，再跑胶回收
就能去除gDNA
elute |
|
|
v********e
发帖数: 1597 | 30 这种情况你只能一一排除，
首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
率不是问题，
第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
蛋白，也可以检测的到 |
|
h********y
发帖数: 79 | 31 根据之前的网上特别是知乎的爆料以及澎湃最新的报道，我觉得lz屁股歪了，这只不过
又是 http://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_1396038
1. 基本没错，根据仅有的信息，鲁解释是中国的寒假造成断续，褚兴趣在果蝇，所以
逄接上。
2. 这点不对，这是推测，我相信鲁实验室没人能点破这一点，光遗传学这么多年了，
磁遗传学，声遗传学啥的概念此起彼伏，你看moser对张事件的评价就知道，想到磁遗
传学这不是什么秘密，怎么可能要张点破，看澎湃上说的鲁有“充分证据”，肯定是有
底气的。
3. 还有质粒抽提，鉴定，再加上逄是4月-8月一直在做课题，这样的工作量与龙晓阳比
，做生物的可以衡量一下。
4. 逻辑问题太大，如果说龙是张的得力干将，8月前张鲁未闹翻，怎么可能鲁压着她的
转导，应该是大力帮忙转导才对吧。我分析的事实是，龙帮张做实验可能鲁不知道是私
下的，因为这是非常恶劣的行径，任何PI也不能容忍。另外叶给张带孩子，就算帮龙做
实验？
5. 你这是基于第二点，别人还没有公开证据，听张龙一面之词，就说鲁在一月份没有
磁遗传学的想法太武断。
6. 这肯定... 阅读全帖 |
|
h********y
发帖数: 79 | 32 根据之前的网上特别是知乎的爆料以及澎湃最新的报道，我觉得lz屁股歪了，这只不过
又是 http://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_1396038
1. 基本没错，根据仅有的信息，鲁解释是中国的寒假造成断续，褚兴趣在果蝇，所以
逄接上。
2. 这点不对，这是推测，我相信鲁实验室没人能点破这一点，光遗传学这么多年了，
磁遗传学，声遗传学啥的概念此起彼伏，你看moser对张事件的评价就知道，想到磁遗
传学这不是什么秘密，怎么可能要张点破，看澎湃上说的鲁有“充分证据”，肯定是有
底气的。
3. 还有质粒抽提，鉴定，再加上逄是4月-8月一直在做课题，这样的工作量与龙晓阳比
，做生物的可以衡量一下。
4. 逻辑问题太大，如果说龙是张的得力干将，8月前张鲁未闹翻，怎么可能鲁压着她的
转导，应该是大力帮忙转导才对吧。我分析的事实是，龙帮张做实验可能鲁不知道是私
下的，因为这是非常恶劣的行径，任何PI也不能容忍。另外叶给张带孩子，就算帮龙做
实验？
5. 你这是基于第二点，别人还没有公开证据，听张龙一面之词，就说鲁在一月份没有
磁遗传学的想法太武断。
6. 这肯定... 阅读全帖 |
|
H**T
发帖数: 3007 | 33 我不支持其中的任何人。
张固然在学术道德方面没有大错，但人品方面确实有很大的问题。没有将逄列为作者之
一，没有将谢列为作者，在清华的调查没出结果之前抢发论文。他这样做，即便清华没
有将其免职，以后国内其他人基本都不会跟他合作。
2015年4月逄向张提及MagR, 张被点破，而不是张点破别人，张是因逄提及MagR而获得
启发，进而与谢合作，做MagR磁遗传学方面的研究。其实谢早就想到这个idea,并在
申请专利时提及这个idea。张与谢的合作导致这个idea的迅速实现。
逄作为课题的主要参与者（4月-8月，从课题一开始就参与了），虽然只做了细胞和转
染方面的实验 （质粒抽提，鉴定都属于转染方面的实验，是转染的基础工作和准备）
，毕竟他也是个博士生，需要论文毕业，把他列为作者之一是常规做法。当然，张把他
当作技术员，仅仅在致谢部分提及他的贡献也无何不可，只是这样做太伤人品。 |
|
k*****n
发帖数: 323 | 34 rc @ 65c 6h-o/n with proteinase k。抽提一次即可，不要抽到下面的有机相。 |
|
v********a
发帖数: 646 | 35 以前去除基因组DNA，都是用DNASE消化之后，用酚-氯仿抽提。现在动辄就是十几个细
胞培养板，这种方式已经不合适。试用了几家的gDNA removal kit，效果都不是很理想。
请问，有没有一种简便可靠的方法，去除RNA里面的基因组DNA，并且不会残留DNASE污
染，影响下游cDNA合成？ |
|
发帖数: 1 | 36 其实就是最基本的pcDNA3.1 plasmid。
以前他做实验都用没有质粒的做对照，有一次labmeeting我show出来的用pcDNA做对照
然后他就一直问我要。一开始我就给了100ug，现在用完了又来问我要。关键是这东西
可以自己养细菌扩增纯化，东西不值钱，但是每次纯化我还需要时间。
怎么拒绝比较好些？ |
|
a******r
发帖数: 786 | 37 你去问你的老板啊，如果两人关系不错，你拒绝的话可能还吃瘪 |
|
发帖数: 1 | 38 我要是你的话我就做个Maxiprep.每次来要就给他100ug. 没必要为了这点小事驳人面子
。人情比这点质粒重要了不止一万倍。 |
|
|
j****n
发帖数: 3370 | 40 把e coli strain给他
就是自己group的 也不见得有义务提供大量vector |
|
l***y
发帖数: 638 | 41 就说用完了给ecoli自己提，其实质粒不值钱有的多就给吧大家省事 |
|
|
I******i
发帖数: 203 | 43 你给他1ul，让他自己做mini或者max之后给我还100ul。如果他不答应，你就拒绝他 |
|
l*******1
发帖数: 16217 | 44 如果是隔壁性感白妞要质粒，楼主肯定屁颠儿屁颠儿的双手奉上，肯定不会在这里唧唧
歪歪了
人那。。。。。。。。 |
|
|
|
|
|
f*******e
发帖数: 354 | 49 你就给他一管里面只有一点点，就说全在这里了，全给你了，你做个大抽还我一点保个
种。 |
|
|
