y******8
发帖数: 1764 | 1 大段的promoter相同序列，克隆，表达都会有重组，silencing问题。如果有特殊菌株或者细胞系，可以
一试。
如果用很短的序列，如TetO，问题不是很大。可以同时驱动基因很多表达。 |
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l*****i
发帖数: 1163 | 2 我现在做的分子方面的实验，构建载体原核表达，共构建了9个基因在PET 28C上，就3
个表达了，而且优化诱导后还是包涵体表达，请问怎么增加包涵体复性的机会？多谢了 |
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c********r
发帖数: 189 | 3 详细说说为啥放到一个construct里。。。据我所知至少两种方法，
1 用bidirectional 的promoter，一边放一个mRNA，同时表达两个mRNA
2 用普通promoter，两个mRNA连起来，中间加一个自酶切site，蛋白表达后，自动从中
间剪开成两个蛋白。 |
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x*****o
发帖数: 441 | 4 我之前也是用一个师兄留下的质粒,在ecoli里面怎么也不表达,测序也是对的.
后来就酶切,发现那个质粒很小,不是普通的,在ecoli里面用得pET. 后来我就把那个片
段切下来,连到pET上面,再筛选,就表达了.
不过你切下来又连的也不行应该跟我的问题不一样. 测序试试吧.
有的人走之前就是会留下很多烂东西......... |
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 Congratulation!
If you try that successful others same BAC and same protocol and same
materials
then you try again and again it is still negative.
And not only you but your college PD does it again and also it is negative=
It seems that paper might had misconduct
likes below blog shown:
//md-anderson-cc.blogspot.com/
or some trigger around it.
That is more interesting than you get positive data from that paper.
回复]
发信人: amysf (kdfa), 信区: Biology
标 题: 请教鼠基因在人细胞的表达
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Feb 7 23:1... 阅读全帖 |
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v***a
发帖数: 1242 | 6 想在细胞中超量表达一个蛋白，在克隆过程中试过在这个蛋白的open reading frame头
尾设计引物，可是都没有成功的，感觉是引物设计得不好。后来就选了5'和3'的UTR区
域设计引物（离start codon和stop codon都有比较远的一段距离)。请问这样的引物可
以吗？会不会对蛋白表达产生什么影响？谢谢！ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 7 谢谢牛牛。
1。我设计引物直接把ORF从pcdna质粒上扩增出来，然后装入pENTR，再到destination
病毒载体。
pcdna质粒表达没有问题，wb检测多次；pENTR也测了序。kozak序列倒是没有，因为
pcmv是强启动子。我将试试单转lentiv vector.看看表达与否。
2。p24是病毒的蛋白吗？
3。infection效率不知道。我要老老实实地作一次。 |
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h******t
发帖数: 56 | 8 我和你有一样的问题。也是用的pEN entry vector 然后做LR reaction 到目的lentivirus vector 里面。我的三个蛋白都有GFP，所以我能测到virus的表达。但是titer非常低，大概只有5%这个样子，而我的GFP control可以有40%。我的这个project暂时已经不做了，就是因为无法表达我的蛋白。现在看到你的帖子，觉得很有可能我们是同样的问题。可以考虑用一个不需要LR reaction的vector来试试 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 9 去年有篇cell文章作者改装plko.1表达cDNA.
他去掉u6启动子，然后装上CMV启动子和基因表达。
问题是加尾信号咋办
有人说不能有加尾信号，会中止病毒RNA的...
搞糊涂了... |
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h********n
发帖数: 4079 | 10 高人们能不能推荐一个lentiviral vector, 可以表达两个外来的gene, 比如
luciferase 和 Cre, 同时还能表达一个shRNA?
tyler jacks的那个 UbC.Luciferase.PGK.Cre 好用吗?
谢谢谢谢. |
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b****r
发帖数: 17995 | 11 我做出来了上百个基因，有没有什么办法可以快速得到每个基因在胎盘里是不是表达？
最好还能得到表达量的大概高低
能用的方案三个包子致谢吧 |
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z****u
发帖数: 1007 | 12 tetO driven, 表达某个gene的RNAi序列来knock down 其表达。
至少在Jax没有这样的老鼠。 是为啥呢。knockdown 的效率不够高导致没有phenotype?
有谁懂的讲讲？ |
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u**********d
发帖数: 573 | 13 看起来非常有意思：几千个受体，但是每个细胞里面只表达一种；每个受体只由一个等
位基因表达，另一个关闭。有了解的八卦一下呗。 |
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p****z
发帖数: 31 | 14 用某种药物刺激细胞，发现某个蛋白表达升高，但是该蛋白的表达不会随着药物浓度的
变化而变化，这其中的机制可能会是什么？希望大家提供意见参考一下，谢谢！ |
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i*********0
发帖数: 915 | 15 我也觉得奇怪，在我的那个line 的“es” cell中，有Tuj1的表达，但是，一分化，
tuj1就不表达了，但是在分化以后，tuj1在neuron中又开始出现了。 |
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c*********8
发帖数: 369 | 16 请教各位大侠，最近花了很长时间想弄个GFP-golgi表达的3T3玩玩,但是用 Fugene HD
转染后效率很低， 荧光超级弱， 持续2-3天就不行饿了，想问下版上那位大牛玩过这
类稳定表达的细胞系，能否分享一点质粒或细胞，小弟愿意提供邮寄的费用及一定的报
酬，谢谢 |
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S******e
发帖数: 393 | 17 在考虑做两个基因在同一个质粒的construct,所以想起来这个问题。
若把一个ORF后面的 SV40 PolyA 去掉（后面紧跟另一个CMV promoter + another ORF
），还会表达么，还是说有弱的表达？ |
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S******e
发帖数: 393 | 18 两个质粒共转染效率比较低，我希望大多数细胞同时表达两个基因，
其实还有个试验是需要三个基因同时在一个细胞里表达，
不知道有什么好的转染方法么，
我用lip2000，总达不到希望的效果 |
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m*******r
发帖数: 202 | 19 我们发现在小鼠中knock out我们的靶基因X可以显著地促进细胞的增殖。我们的靶基因
X是一个重要的抑制性转录因子。随后，我们用分别来自wild-type和knockout小鼠的组
织做了RNA-seq分析，想鉴定出我们靶基因X最重要的介导因子。我们获得了很多差异性
表达的基因。请问大家是用什么方法或标准首先从这些差异性表达的基因里筛选出候选
的最重要的介导因子的？然后，再设计实验进行验证。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 20 in vivo表达系统尽量避免pCMV是共识。我的经验是pCMV在小鼠肝脏中大约2-3周后就会
被沉默。如果仅仅“瞬时”表达的需要，可能没太大问题，否则还是用pTTR或者pALB甚
至pUBC比较稳妥 |
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d***s
发帖数: 1062 | 21 小弟正用逆转录病毒在小鼠CD4 T细胞中过表达目的蛋白。病毒质粒是MCSV骨架，目的
基因和GFP之间有IRES连着。对照组CD4 T细胞GFP阳性率有70%。实验组CD4 T细胞GFP
阳性率只有40%，而且GFP的强度也比对照组要弱很多。看了几篇文章转的是同样的基因，
同样也是逆转录病毒但是不同质粒，他们的结果就非常好，实验组GFP的强度和对照组
的差不多。
抱歉描述的有点乱了。我的问题是有什么办法能增加我的实验组T细胞GFP的强度，也就
是增加目的蛋白的表达量吗？先谢谢大家了。 |
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l***g
发帖数: 19 | 22 没用过这个载体的病毒质粒，不是很清楚。为啥目的基因和GFP之间要有IRES连着，GFP
不能和目的基因直接融合吗？一般IRES和筛选基因连着比较有用吧。如果你的GFP阳性
率偏低并且表达量不高的话，可以试着病毒感染后再挑选单克隆细胞，挑那种表达量高
的。 |
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b****e
发帖数: 52 | 23 最近在检测一个蛋白在KO老鼠brain的表达,因为没有littermate对照,只能用其他
strain的.结果发现即便WT表达好像也差很多.请教大家这种情况常见吗?谢谢! |
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c******t
发帖数: 108 | 24 求助啊~siRNA转染组比对照组有更高的目的基因的表达 （大概高30-40%），且统计学
上P<0.01.
完全按照protocol来，应该没标错样品，转染了2天后，换成正常的培养液，再过2天，
收了细胞，提了RNA，做了PCR。怎么会这样？
有没有可能siRNA在转染4天后就失效了？转染组细胞为了弥补之前的“被抑制”，就更
多的表达目的基因？
谢谢大侠们！ |
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z*****3
发帖数: 32 | 25 打听一下whole genome检测基因表达的问题，现在有一个蛋白，想检测一下敲除后在
human
cell里边会抑制哪些基因的表达。但是没做过细胞实验，所以不了解，想打听一下：
1.一般的收费是多少？
2. 自己需要做的是什么工作？
3. 如果自己没有这个敲除基因的细胞株的话，哪里可以买到？
4. 一般共需要多久的时间？
因为没做过这方面的实验，不了解，可能问的问题有些幼稚。希望了解这方面的人给予
指点，谢谢！ |
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z*****3
发帖数: 32 | 26 谢谢你的回复，醍醐灌顶呀。经过你这么一说我就明白多了。不好意思之前主要是做蛋
白表达纯化测性一类，没有接触过seq或者ChIP相关的实验，所以对这方面不了解。
现在的情况是我们有一个蛋白可能抑制表达，想看看在in vivo是有什么影响。老板有
钱但是要给他一个很好的具体一些的proposal和quote，他觉得很有兴趣就会支持的。
我们实验室没有做这个方向的，估计要送到公司做。但是如果真的数据很interesting
的话还是值得的。我会问下华大的quote的。
谢谢你的回复和建议。 |
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m*****u
发帖数: 15526 | 27 这个不高吧？human和mouse细胞promoter activity是有差别的。比如CMV在mouse细胞
就表达低。不知道哪个能表达高点？ |
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m*****u
发帖数: 15526 | 28 这个不高吧？human和mouse细胞promoter activity是有差别的。比如CMV在mouse细胞
就表达低。不知道哪个能表达高点？ |
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b*********e
发帖数: 870 | 29 没太看懂。。。。
你是想用一个同样的信号肽带着不同的FPs，同时表达在一个细胞里？那他们三个都会
去同一个地方吧？比如你用CAAX，就会到膜上。
那你担心什么样的overlapping 问题？你这个表达的要求，他们三个的信号难道不是永
远在一起么？ |
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e***o
发帖数: 344 | 30 多谢各位的回复。应该是我没有表达清楚。这几种蛋白的ex/em肯定是可以分开的。我
的目的是想这几个蛋白分子在物理空间上分得比较开。这一点用靠分辨显微镜是比较容
易的，但在一般显微镜下，由于XFP表达都很多，就混在一起了，分子和分子之间分不
开。
最好就像做DNA FISH的染色，分得很开。 |
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j*p
发帖数: 411 | 31 1. RPKM = 1 约等于 1 copy/cell. 同样是rpkm=1，如果这个是从100M reads出来的，
可信度比从10M来的高。同时，RPKM=1可以通过单细胞FISH验证。
2. qPCR 灵敏度比100M RNAseq高，能够validate RPKM=0.1左右，就是cycle要多些。
3. 即使没有replicate，也可以做统计，cufflinks, DESeq 都有这样的选项（简单的
fisher-exact test），但得出的pvalue显然没有那些有replicate的来得靠谱。
4. 做表达量的时候，通常会用 log2(RPKM+1)，然后做fold change的时候，会用log2
的差，+1既是为了去0，避免fold change = 无穷大，也是为了减少对那些表达量很小
的RNA的fold change的over estimation。 |
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j*****4
发帖数: 43 | 32 我们正在研究的一个课题发现一个基因有polymorphism，但离那个基因的3’端有几十
kb。这个polymorphism与该基因的表达有紧密关系（有些突变会高度上调这个基因的
mRNA和蛋白水平）。我所知道的polymorphism一般在基因的转录调控区域或外显子内含
子之类的，这样的话调控基因的表达比较解释得通。但在距3‘端这么远的
polymorphism怎么调节基因的mRNA水平我就不知道了。有没有可能是因为DNA的三级结
构受到突变的影响？或者是epigenetics的变化引起的？我没有genomic和epigenetic的
背景，诚心向大虾们求教～ 不胜感激～～～ |
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i*****i
发帖数: 154 | 33 我们想做的是LncRNA的差异表达，本来打算用array来做的，比起传统的array，LncRNA
的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息，而且作Multiplexing
的话，一个lane可以做4-6个sample。
不过刚入门，或者说还没有入门，没有经验。
我们用Core的service。
他们提供两种flow cell，一种是8个lane的Hi-Seq2000，每条lane能得到180M的reads/
Clusters。如果是pair end的话，当然还是180M的clusters，但是reads就加倍了。另
外一种是HiSeq2500，2-lane的flow cell，rapid mode，大概能出300M的reads/
clusters, PE cluster不变，reads加倍，当然价钱也比较贵，但是turnaround time很
快。
就传统的8个lane的Hi-Seq2000而言，一个sample大概能拿到40-50M的数据（cluster）
，pair end测序的话，大概80M左右（两次测序算两个reads，但是他们来源
于一个clu... 阅读全帖 |
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L****e
发帖数: 499 | 34 想用NIH3T3 作细胞模型研究 FGF21，但是不知道NIH3T3 是否表达 FGF21的受体
betaKlotho 和FGF1Rc，因为不是主要的课题，所以不想也没钱去买这两个抗体验证了
，想请教一下有没人知道或者有这方面的经验。另外NIH3T3 是实验室用得很多的一种
细胞了，它的基因表达谱不知这么去查？
多谢了 |
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b*********8
发帖数: 44 | 35 感谢回复！
我做的是植物的。 我现在想过表达一个miRNA, 已经知道他的stem-loop序列，也blast
到了他的部分genome序列，但没找到cDNA序列。我如果直接根据genome序列，在这段
stem-loop序列两边各加上100bp边界序列做过表达，可以吗？我担心这段边界序列不会
正好在intron区吧,会不会影响发夹结构的形成？ |
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j******n
发帖数: 941 | 36
我的经验是切割率大约80% 整体表达效率比IRES高 而且在某些情况下 IRES前后两个
ORF表达情况不成比例 |
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b******9
发帖数: 425 | 37 做了个construct，转primary newborn astrocytes，用hygromycin来筛选stable
transfection，可是一直都没有筛出来，细胞全都死光光了。转染效率还算可以，是电
转，有30%左右。hygromycin浓度也不算高，50ug/ml。
hygromycin是用TK promoter表达的，不知道是不是因为promoter不行。试了别人的一
个puromycin construct，是pGK promoter，也基本上死光了。想问一问版上牛人有没
有经验可以传授。多谢多谢！
另外我是用CMV promoter来表达我要的基因，先转细胞，然后筛选stable line打到老
鼠上。听说CMV promoter在体内可能会被shut down，是不是也应该换掉呢？谢谢！ |
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d**********r
发帖数: 36 | 38 这应该是一个膜蛋白在心里的表达（IHS）请问在心脏里表达在什么位置呢？我不懂动
物组织。多谢指点 |
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o******u
发帖数: 117 | 39 现在实验有个问题请教大家：某受体已经知道在所有哺乳动物都表达，现在我比较感兴
趣它在人和老鼠之间表达，或者是对其内源配体的结合活性上有无差异，该如何设计实
验来证明？我自己能想到的是用传统的Western 或FACS来半定量，但问题是如何区分抗
体结合活性的差异？求教大家，谢谢了。 |
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b******y
发帖数: 19 | 40 想看看我感兴趣的基因在各种疾病情况下有没有表达的变化，请高人推荐一个好的
microarray或其他基因表达的网站。简单易用的，不需要自己再做复杂的生物信息操作
。多谢多谢！ |
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n******7
发帖数: 12463 | 41 micro-array因为probe的亲和性不可比，所以荧光强度只有相对意义，只能一个gene自
己比
不知道是我在那里看到的，还是我自己先入为主了，一直觉得RNA-seq可以测量到绝对
表达值，RPKM/FPKM在各个gene间是可比的
但是仔细一想，一个mrna各个区域能被sequenced的几率都不一样，各个gene间也有有
些说不清楚的差异吧？这样用RPKM来比较不同gene表达还是有些问题的吧 |
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n******7
发帖数: 12463 | 42 恩，这个同意
我是在琢磨一个基于绝对表达值的方法，如果各个gene表达值不是那么可比，这方法就
不那么有意义了 |
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r**a
发帖数: 121 | 43 可能确实是promoter的问题，pMT诱导GFP，很多时候直接看都看不到荧光，western可
以检测到。如果没有别的办法，用pAc5试试吧。
我一般都尽量避免用果蝇细胞表达蛋白，如果实在要，干脆用果蝇表达，用cage收集卵！ |
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s******9
发帖数: 45 | 44 可以用PUAST的载体，不过要同时转入一个表达Gal4的质粒。同样量的DNA表达出的蛋白
量比pAc和pMT高很多。 |
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s***m
发帖数: 6197 | 45 invitrogen是不是有一个S2的表达系统(secretion vector)，能把要表达的蛋白分泌到
细胞外，这样纯化就比较容易了 |
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v*******1
发帖数: 34 | 46 想找一种miRNA，在某种细胞里表达，在另一种细胞里不表达，板上的大牛小牛们可以
给点建议吗？
或者有什么data base 可以查miRNA 在不同细胞的 expression level？
老板一拍脑袋的idea，我也没做过细胞里的东西，愁死了 |
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s**********a
发帖数: 92 | 47 一个蛋白，分成几个片段，MYC tag，转染进２９３T，其他片段都能用anti－MYC
antibody 检测到，只有分子量最小的那个 (70 个氨基酸,加上Tag啥的，总共不超过
10KD。)，检测不到。但把这个片段克隆进原核表达
载体能在细菌中表达。
请问这是一种什么情况，大家遇到过么，怎么解决，谢谢！ |
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a****d
发帖数: 1919 | 48 个人经验， lentivirus （ubiqutin promoter） 感染的细胞，12小时后可以看到eGFP
表达。 CAG-CMV promoter based lenti也能很快看到外源基因表达。
我培养的原代细胞，D0用lenti处理，D3 固定染色，没有问题。 |
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C******2
发帖数: 97 | 49 求助各位作ＨＢＶ的行家，我是最近才接触这个领域，我想在ｈｕｈ７ 或者Ｈｅｐｇ
２中稳定表达ＨＢＶ Ｂ型的侵染性克隆（４．３Ｋ），试了几次都没有成功，用ｌｅ
ｎｔｉ载体又由于插入片段过大，ｔｉｔｅｒ过低不能造成有效的感染，我的感觉是稳
定表达ＨＢＶ的ＨＵＨ７ 细胞好像由于ａｐｏｐｔｏｓｉｓ不能进行正常的生长，请
问大家，有这种可能么？或者大家有什么建议，请不吝赐教
非常感谢各位的帮助 |
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j****x
发帖数: 1704 | 50 建立HBV expressing cell line，用HuH7大概不是个好选择，因为其分化程度低且敏感
，病毒在其中的复制效率相对较低，比不上HepG2。
此外，如果你想建立表达HBV Genotype B型的细胞系，必须要筛选细胞培养适应性病毒
株，而不能直接用患者体内分离到的毒株或者所谓基因型“标准株”，因为这些
clinical isolates在细胞培养条件下的复制能都很差，需要在体外培养条件下积攒一
系列的适应性突变才有可能在细胞系中高表达，尤其对于本身复制能力就相对差的B型
HBV病毒。目前广泛使用的几种HBV expressing cell line例如HepG2.2.15/HepG2 H1.3
等，都采取了类似的策略。 |
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